抗中性粒细胞胞浆抗体的两种检测方法比较

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　　【摘要】 目的 比较线性免疫分析法(LIA)与间接免疫荧光法(IIF)检测抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)的性能,评价两种方法在ANCA检测中的应用效果。方法 用LIA法和IIF法对92份自身免疫性疾病患者血清和160份健康献血者血清进行检测,用χ2检验,对两种方法结果进行比较分析。结果 LIA法阳性率为6.4%(16/252),其中PR3阳性率为2.4%(6/252),MPO阳性率为4.0%(10/252);IIF法阳性率为8.7%(22/252),其中C-ANCA阳性率为3.5%(9/252),P-ANCA阳性率为5.2%(13/252)。在经确证为血管炎的19例标本中,LIA法检出阳性16例,假阴性3例,敏感性为84.2%(16/19),准确性为100%(16/16); IIF法检出阳性23例,假阳性4例,敏感性为94.7%(18/19),准确性为81.8%(19/23)。两种方法的敏感性和准确性比较均有显著性差异(P<0.01)。 结论 两种方法检测ANCA的阳性率的比较差异无显著性(P>0.05);但IIF法相对敏感,LIA法有较高的准确性,两者联合检测可提高ANCA的检出质量。
　　【关键词】 抗中性粒细胞胞浆抗体; 线性免疫分析法; 间接免疫荧光法
　　
　　The study on detecting anti-neutrophil cytetoplasmic anti-autoantibody(ANCA)
　　
　　KE Zong-ming.The people’s hospital of yun xian in Hubei,Yunxian 442500,China
　　【Abstract】 Objective To compare the properties of Line Immunoassay(LIA) with Indirect Immunofluorescent(IIF) in detecting anti-neutrophil cytetoplasmic anti-autoantibody(ANCA) and evaluate their effectiveness.Methods Serum samples of 92 patients with autoimmune diseases and 160 healthyblood donors were detected with LIA and IIF separately,then compare those testing results.Results LIA method showed that positive rate was 6.4%(16/252),in which PR3-positive rate was 2.4%(6/252),MPO-positive rate was 4.0%(10/252); and IIF method showed that positive rate was 8.7%(22/252),where C-ANCA positive rate was 3.5%(9/252),P-ANCA positive rate was 5.2%(13/252).After the confirmation of 19 specimens,LIA method detected to show that 16 cases were positive and3 cases were negative,the sensitivity was 84.2%(16/19),accuracy was 100%(16/16); IIF method reviewed that the 23 cases positive,false positive in 4 cases,the sensitivity was 94.7%(18/19),accuracy was 81.8%(19/23).The sensitivity and accuracy of the two methods had a significant difference (P<0.01).Conclusion The difference of the two detecting positive rate of ANCA resultswas significant(P>0.05),while IIF method is relatively sensitive,LIA method has high specificity.Combination of the two detection methods can improve the quality of detection of ANCA.
　　【Key words】Antineutropil cytoplasmic antibodies(ANCA);Line Immunoassay;Indirect Immunofluorescent
　　
　　ANCA是一种针对中性粒细胞和单核细胞胞浆成分的自身抗体,临床上主要用于诊断Wegener肉芽肿、原发性小血管炎、炎性肠病等系统性血管炎疾病[1],现已成为临床常规检测项目。目前常用测定ANCA的方法有IIF,IIF可将ANCA分为胞浆型抗中性粒细胞胞浆抗体(C-ANCA)和核周型抗中性粒细胞胞浆抗体(P-ANCA),而蛋白水解酶3(PR3)是C-ANCA的靶抗原,髓细胞过氧化物酶(MPO)为P-ANCA靶抗原[2]。作者采用LIA和IIF法对252份血清ANCA进行检测比较,结果如下。
　　1 材料与方法
　　1.1 标本来源 252份血清标本来自临床不同患者和健康献血者,其中92例患者包括系统性红斑狼疮40例,类风湿性关节炎21例,血管炎19例,系统性硬化病7例,干燥综合征5例,以上病例均符合1982年美国风湿病协会(ACR)修订的诊断标准。
　　1.2 检测方法
　　1.2.1 标本采集 静脉取血4~5 ml,置干燥试管中待凝固后分离血清,-20℃保存。
　　1.2.2 线性免疫分析法(LIA)本试剂由德国IMTEC公司原装生产。将核抗原印迹于硝化纤维膜上,封闭非特异反应区,纤维膜然后被切割成膜条。模条上的抗原与特异性抗体结合后除去未结合蛋白,加入辣根过氧化物酶标记的抗人IgG二抗与之结合,最后加入无色的TMB底物,结合抗体表现为可见的兰色免疫复合物。结果判断:待膜条完全干燥后与试剂盒提供的判读卡比较Cut-Off、PR3、MPO三条带。阳性结果:条带颜色比Cut-Off相同或更深;阴性结果:条带颜色比Cut-Off浅。
　　1.2.3 间接免疫荧光法(IIF) 使用欧蒙公司的粒细胞马赛克试剂盒,每张生物载片上包被有乙醇、甲醛固定的粒细胞,血清及抗体均用PBS (pH 7.2)稀释,加1:10稀释待测血清、阴性、阳性对照血清,温育洗涤后加异硫氰酸荧光素(FITC)标记羊抗人IgG,温育洗涤后,滴加甘油用盖玻片封片,于荧光显微镜下读片。结果判定:中性粒细胞不出现特异性荧光为抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)阴性。胞浆型抗中性粒细胞抗体(cANCA)阳性:显示均匀分布在整个中性粒细胞胞浆中的颗粒型荧光,细胞核无荧光。核周型抗中性粒细胞抗体(pANCA)阳性:在中性粒细胞核周显示光滑的带状荧光。

　　2 结果
　　2.1 两种方法对92份患者血清和160份健康献血者血清进行检测结果比较:LIA法阳性率为6.4%(16/252),其中PR3阳性率为2.4%(6/252),MPO阳性率为4.0%(10/252);IIF法ANCA阳性率为8.7%(22/252),其中C-ANCA阳性3.5%(9/252),P-ANCA阳性率为5.2%(13/252)。两种方法检测阳性率用 χ2检验,差异无显著性意义(P>0.05),见表1。
　　2.2 敏感性与准确性 252例标本中19例确证为血管炎。LIA法检出阳性16例均确证为血管炎,敏感性为84.2%(16/19),准确性为100%(16/16),假阴性3例; IIF法检出阳性22例包括系统性红斑狼疮2例,类风湿性关节炎1例,血管炎18例和系统性硬化病1例,敏感性为94.7%(18/19),准确性为81.8%(18/22),假阳性4例。见表2。LIA法和IIF法的敏感性比较,有显著性差异(P<0.01),准确性比较也有显著性差异(P<0.01),见表2。
　　3 讨论
　　NCA为血管炎的一项敏感的血清学标志。本研究结果如表1显示,LIA法中PR3阳性率为2.4%,MPO阳性率为4.0%;IIF法中C-ANCA阳性率3.5%,P-ANCA阳性率为5.2%,两种方法检测阳性率差异比较,无显著性意义(P>0.05)。目前有10余种中性粒细胞细胞质成分被证实为ANCA的靶抗原[2],还有许多未知的靶抗原待确定。LIA法抗原成分经重组纯化后标记,有针对性地检测PR3和MPO两种ANCA的靶抗原。但LIA法对PR3和MPO以外的ANCA靶抗原会漏检。目前IIF法是检测ANCA的常用方法。随着对ANCA的深入研究,发现与之相关的疾病越来越多,IIF法检出的ANCA阳性并不一定意味着血管炎[3]。IIF法检出4例假阳性包括系统性红斑狼疮2例、类风湿性关节炎1例和系统性硬化病1例。由于乙醇固定的中性粒细胞中同时存在线粒体、高尔基体以及核糖体P蛋白等,若被检血清存在相应自身抗体则可与之结合,会呈现强弱不等的荧光,影响对ANCA的检测[4]。由表2可见,IIF法敏感性为94.7%,较LIA法敏感性要高。但LIA法相比IIF法具有较高的准确性。
　　自身免疫病本身有大量自身抗体表达,特别是ANA滴度较高时,鉴别非常困难。从而增加了假阳性率,降低了特异度。IIF法检测ANCA相对敏感,虽然它能区分P-ANCA和C-ANCA,但不能准确地区分出属于哪一种靶抗原相关性抗体,故可作为筛选试验。LIA法能特异地检测PR3-ANCA与MPO-ANCA,但不可替代IIF法检测总ANCA。因此LIA法可作为IIF法的有效补充,进一步提高ANCA检测的敏感性和准确性。
　　参考文献
　　[1] 赵秀芬,孙彬,钱军,邢昌赢.抗中性粒细胞胞浆抗体的检测方法及临床意义.实用临床医药杂志,2008,12(6):79.
　　[2] 陈武.间接免疫荧光法与酶联免疫吸附试验对比检测抗核抗体.检验医学与临床,2006,3(7):374.
　　[3] 罗冰,王艾丽,虞伟.4种自身抗体对问接免疫荧光法检测抗中性粒细胞胞质抗体的影响.医学研究生学报,2009,22(2):124.
　　[4] 王涛,李季青,陈琳洁.线性免疫分析法检测39例系统性红斑狼疮患者血清抗核抗体谱结果分析.实用医学杂志,2007,23(l5):2426.

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