慢性间歇性低氧对颏舌肌超微结构及ROS的影响
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【摘 要】 目的：观察慢性间歇性低氧（CIH）过程对颏舌肌超微结构及ROS的影响。方法：选用20只健康成年雄性SD大鼠随机分为对照组和CIH组（n=10）。将CIH组大鼠置于低氧箱中，每天8小时，持续4周间歇性低氧。低氧结束，取出颏舌肌组织，电镜观察细胞超微结构的改变;冰冻切片免疫荧光方法检测颏舌肌中活性氧（ROS）的水平。结果：电镜观察结果显示，与对照组相比，CIH组肌原纤维结构杂乱，部分肌丝溶解，肌原纤维间线粒体集中、大小不一、水肿，嵴断裂、空泡变;冰冻切片免疫荧光染色显示CIH组ROS数量较对照组显著增多。结论：慢性间歇性低氧过程可破坏颏舌肌细胞超微结构，并引起颏舌肌产生显著的氧化应激反应。
【关键词】 慢性间歇性低氧;颏舌肌;细胞结构;氧化应激
【中图分类号】R821.4+2 【文献标志码】A【文章编号】1005-0019（2019）12-019-02
阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征（OSAHS）在全世界成人中发病率为2%-7%，其特征为反复发作呼吸暂停，严重打鼾和白天嗜睡[1]，导致慢性间歇性低氧（CIH）。研究表明，CIH可引起血中氧化应激水平显著升高[2]。间歇性低氧可使体内产生过多的自由基和ROS，从而激活人体的氧化应激状态。ROS能抑制软骨蛋白聚糖的合成，妨碍ATP的合成，进而影响线粒体功能，造成细胞损伤，用于评估氧化应激的发生[3]。
上呼吸道扩张肌（主要是颏舌肌）的损害是OSAHS病因之一，可能与这种氧化应激状态有关。本研究探讨了一种CIH模型对颏舌肌中ROS活性的影响及其超微结构的改变。
1 材料与方法
1.1 实验动物与分组 20只健康雄性SD大鼠，8周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2016-0006。根据随机数字表法随机分成对照组和CIH组（n=10）。CIH组每天行8h（9：00-17：00）间歇性低氧，连续4周，饲养同对照组。实验结束，麻醉大鼠并解剖颏舌肌组织用于检验。本实验通过北京大学第一医院实验动物中心伦理批准。
1.2 动物模型制备 将CIH组大鼠放入低氧箱（MS-01，北京大学前沿交叉学科研究院）内，循环充入氮气和氧气，60s充入氮气，60s充入氧气，每循环周期120s，确保每一循环箱内氧浓度在10%-21%之间波动，低氧箱传感器可自动检测氧浓度。低氧箱内每日实验结束后进行紫外线照射30分钟杀菌。
1.3 电镜观察颏舌肌超微结构 实验结束后，5%戊巴比妥钠麻醉大鼠，解剖游离颏舌肌组织，并切下1小块（约1mm3），放入2.5%戊二醛磷酸缓冲液中固定，送北京大学第一医院电镜室常规制作标本，电镜观察颏舌肌细胞超微结构。
1.4 颏舌肌组织标本检测 冰冻切片免疫荧光检测ROS;检测均按照试剂盒说明操作。
1.5 统计学方法 采用SPSS17.0软件建立数据文件并进行统计分析，均数以（x±s）表示，计量资料采用独立样本t检验分析，P<0.05差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 体重改变情况 对照组与CIH组低氧前：（315.6±3.6）g、（316.2±5.6）g，P>0.05;低氧后：（501.8±9.3）g、（498.6±14.1）g，P>0.05;低氧前后两组大鼠体重无显著差异。
2.2 颏舌肌组织的超微结构变化 对照组肌原纤维结构整齐排列，明暗带清晰，线粒体形态规则，内膜和外膜完整，嵴丰富。在CIH组中，肌原纤维结构杂乱无序，部分肌丝可见溶解，明暗带排列不清，肌束间的结缔组织增生，肌原纤维间线粒体集中、大小不一，膜模糊不清，嵴断裂、空泡變，数量明显减少，见图1。
2.3 颏舌肌组织免疫荧光结果显示 DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，ROS阳性表达为相应光素标记的红光，CIH组ROS数量明显较对照组为多，见图2。
3 讨论
OSAHS患者在睡眠过程中存在反复的呼吸暂停和/或低通气现象，这种类似于缺血-再灌注损伤的周期性低氧-复氧循环模式促使白细胞活化，导致超氧化物自由基生成增多[4]，氧化-抗氧化系统失衡，产生氧化应激反应。而ROS的产生超过局部抗氧化能力时，又会加重氧化应激，进一步导致组织细胞受损。颏舌肌是引起上气道开放的最大扩张肌之一，它收缩时引起舌肌向前移动，使咽气道开放，从而确保了肺部的有效通气。电镜结果显示，CIH组颏舌肌肌原纤维结构杂乱无序，线粒体水肿，嵴断裂、空泡变。线粒体是细胞中最关键的细胞器，在维系正常细胞功能过程中发挥着重要作用。氧化应激可致线粒体受损，介导细胞凋亡，从而影响颏舌肌收缩功能，致使睡眠过程中收缩力减弱，咽部气道无法完全或不能打开，进而引起低通气甚至呼吸暂停，周而复始，逐渐加重OSAHS的严重程度。
综上所述，本研究发现CIH组颏舌肌中ROS含量升高，且线粒体结构不同程度受损，提示CIH后颏舌肌组织内存在脂质过氧化物损伤，进一步证实了CIH可激活氧化应激状态。从临床角度来看，OSAHS疾病可能破坏患者颏舌肌的肌细胞结构，并引起颏舌肌组织内部产生显著的氧化应激反应。
参考文献
[1] Punjabi NM.The Epidemiology of Adult Obstructive Sleep Apnea. Proceedings of the American Thoracic Society，2008，5（2）：136-143.
[2] Zhao YN，Wang HY，Li JM，etal.Hippocampal mitogen-activated protein kinase activation is associated with intermittent hypoxia in a rat model of obstructive sleep apnea syndrome[J].Molecular Medicine Reports，2016，13（1）：137-145.
[3] Helen G，Griffiths R，Lennart，et al. Biomarkers. Molecular Aspects of Medicine， 2002.23（1-3）：101-208.
[4] 何权瀛，陈宝元，张希龙.解读“睡眠呼吸暂停与心血管疾病专家共识”[J].中国实用内科杂志，2010，30（02）：116-121.
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