慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者呼吸道病毒分布及危险因素分析

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　　[摘要] 目的 探討慢性阻塞性肺疾病急性加重期（acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease，AECOPD）呼吸道病毒感染特点及危险因素。 方法 纳入2017年5月～2019年6月在徐州医科大学附属医院呼吸内科住院的患者。采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）检测患者病毒感染情况，记录患者一般情况、合并症及实验室检查结果，应用Logistic回归分析探讨病毒感染的危险因素。 结果 共收集 AECOPD患者107例。PCR病毒检测阳性例数41例（38.32%）。多因素Logistic回归分析显示，COPD急性加重患者病毒感染的危险因素为1年内急性加重次数（P=0.035）、烟草暴露（P=0.032）、糖尿病（P=0.001）、呼吸衰竭（P=0.075）四种因素。 结论 AECOPD 患者呼吸道病毒感染以鼻病毒及流感病毒最为常见。AECOPD 患者呼吸道病毒感染的重要危险因素是1年内急性加重次数、烟草暴露、糖尿病及呼吸衰竭，对于危险因素的识别及预防可降低 AECOPD 发生率。
　　[关键词] 慢性阻塞性肺疾病;急性加重;呼吸道病毒;危险因素
　　[中图分类号] R725.6          [文献标识码] B          [文章编号] 1673-9701（2019）36-0048-04
　　Prevalence of respiratory viral infection and risk factors in patients with acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease
　　HAO Lu   ZHANG Zhiliang   ZHAO Ling   ZUO Li'na
　　Department of Respiratory Medicine， Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University， Xuzhou   221000， China
　　[Abstract] Objective To investigate the characteristics and risk factors of respiratory virus infection in acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease （AECOPD）. Methods Patients hospitalized in the respiratory department of Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University from May 2017 to June 2019 were included in this study. Polymerase chain reaction （PCR） was applied to detect the virus infection in patients， and the general situation， complications and laboratory test results were recorded. Logistic regression analysis was used to identify the risk factors of virus infection. Results A total of 107 patients with AECOPD were collected， of whom 41 cases （38.32%） were positively confirmed by PCR. Multivariate Logistic regression analysis showed that the risk factors of virus infection in COPD patients with acute exacerbation were acute exacerbation times in 1 year（P=0.035）， tobacco exposure（P=0.032）， diabetes mellitus（P=0.001）， respiratory failure（P=0.075）. Conclusion Rhinovirus and influenza virus are the most common respiratory virus infections in AECOPD patients. The key risk factors of respiratory virus infection in patients with AECOPD are the number of acute exacerbation in 1 year， tobacco exposure， diabetes and respiratory failure. The identification and prevention of risk factors may reduce the incidence of AECOPD.
　　[Key words] Chronic obstructive pulmonary disease; Acute exacerbation; Respiratory virus; Risk factors 　　慢性阻塞性肺疾病（chronicobstructive pulmonary disease，COPD）是世界范围内发病率和死亡率最高的疾病之一。该疾病的临床病程因病情反复急性加重，导致呼吸功能螺旋式下降，引起症状加重和死亡风险增加[1]。越来越多的证据表明，大多数COPD病情恶化与呼吸道病毒和细菌感染有关[2]。对AECOPD患者呼吸道病毒分布和危险因素研究，可为有效预防AECOPD提供重要依据。本研究通过收集患者鼻拭子标本，运用聚合酶链反应技术扩增标本中病原学特异性DNA，寻找COPD急性加重患者的呼吸道病毒病特点，并分析造成感染的危险因素，现报道如下。
　　1 资料与方法
　　1.1 一般资料
　　选取2017年5月～2019年6月在徐州医科大学附属医院呼吸内科住院的患者为研究对象。根据诊断标准及排除标准，筛选慢阻肺急性加重患者107例，所有患者入选前均知情同意并签署知情同意书。
　　1.1.1 纳入标准  ①患者有吸烟、粉尘等危险因素暴露史;慢性咳嗽、气喘病史>2年，每年持续发作>3个月;②呼吸道症状较平日加重，如咳嗽频率增加，咳脓性痰，憋喘加重，需要改变治疗方案。③吸入舒张药物后肺功能FEV1/FVC<70%;④发病至入院前未使用抗感染药物。
　　1.1.2 排除标准  ①合并支气管哮喘、肺炎、活動性肺结核、肺癌、肺栓塞、肺脓肿、弥漫性间质性肺病、气胸等其他肺部疾病;②严重的心、肝、肾等脏器功能不全或其他恶性肿瘤;③严重的呼吸衰竭，需有创性气管插管，呼吸机支持患者。④无法完成慢阻肺评估问卷（chronic obstructive pulmonary assessment test，CAT）、改良英国医学研究学会呼吸困难指数问卷（modified medicalresearch council scale，mMRC）及微型营养评估问卷（micro nutritional assessment，MNA）。
　　1.2 方法
　　入院当日采集患者鼻拭子标本，运用聚合酶链反应技术检测 11种呼吸道病毒。包括：鼻病毒（rhinovirus，HRV），流感病毒甲型、乙型（influenza virus，IV A/B），副流感病毒 1、2、3及4型（parainfluenza virus，PIV 1/2/3/4），呼吸道合胞病毒 A、B型（respiratory syncytial virus，RSVA/B），人类偏肺病毒（human meta-pneumo virus，HMPV），腺病毒（adenoviridae，ADV）。
　　1.2.1 仪器及试剂  荧光PCR扩增仪：美国罗氏公司Light cycler480;低温高速离心机：意大利ALCPM180R型，微量恒温器：北京万通达科技有限公司，荧光显微镜：日本Olympus公司;病毒基因组DNA/RNA 提取试剂盒：QIAamp ViresDNA/RNA Kit;呼吸道病原体多重荧光定量RT-PCR/PCR反应试剂盒：美国Roche公司。PCR纯化试剂盒：QIAquick PCR purification Kit;蛋白酶K上海如吉生物科技有限公司，RNA助沉剂：上海研生实业有限公司，无RNA酶水：美国ThermoFisher公司。
　　1.2.2 核酸提取  应用病毒基因组DNA/RNA 提取试剂盒提取鼻拭子标本中的DNA和RNA。取咽试子标本液200 μL，用25 μL蛋白酶K消化，每管加入28 μg RNA助沉剂，乙醇沉淀后，加入硅胶柱中吸附，洗涤后经6700×g离心，用50 μL无RNA酶水洗脱硅胶柱中的核酸。提取病毒核酸-70℃冰箱保存。
　　1.2.3 RT-PCR步骤  应用荧光定量RT-PCR/PCR反应试剂盒，以反应混合液9.8 μL、酶混合液0.2 μL及模版RNA 10 μL制备反应体系;反应条件：①42℃逆转录30 min;②92℃变性3 min;③92℃ 10 s，45℃ 30 s，72℃ 1 min，循环5次;④92℃ 10 s，60℃ 30 s，循环40次;延伸阶段采集荧光信号，扩增片段在450 bp为HRV，212 bp为IVA，362 pb为IVB，416 pb为HMPV，279 pb为RSVA，180 pb为RSVB，230 pb为PIV1，170 pb为PIV2，260 pb为PIV3，335 pb为PIV4，450 pb为ADV。
　　引物序列（5’-3’）：HRV 上游GGTGTACCTCTCTACTCTC下游CTCTGACTAAGGGGATTTTG;IVA上游CAGAGACTTGAAGATCTCTTTGCTGG下游GCT-CTGTCCATGTTATTTG;IVB上游 AAAATTACACTG-TTGGTTCGGTG下游AGCGTTCCTAGTTTTACTTG;PIV1型 上游TGTAGGAAGTGGGATAGATTGAAA下游GTGTCGCCTTGGAGCGGAGTT;PIV 2型上游AAGTGACAACCAGCAGAGATTCAA下游TGTTGGAACTC-TTCACTGCTCATAC;PIV3型上游CAACCATATGCTGCGCTATACC下游CAAGACCTCCATATCCGAGAA-ATATT;PIV4型上游ATGGGCCGTATCAACACTC-CAG下游GGTTTAACCCAACCTTCACATCAT;RSVA 上游GGAACAAGTTGTTGGTTTATGAATATGC下游TTCTGCTGCAAGTCTAGTACACTGTAGT;RSVB 上游GGTGTACCTCTGTACTCTCGGGACCAA下游TGGCCCCATTAAATGTGTCCTGCCTGAA;HMPV上游CCCTTTGTTTCAGGCCAA下游GCAGCTTCAACAGTA-GCTG;ADV上游 CACGGTGGGGTTTCTAAACTT下游GCCCCAGTGGTCTTACATGCACA。 　　1.3 观察指标
　　1.3.1 收集患者的临床信息  包括年龄、性别、烟草暴露、体育锻炼、规律用药、急性加重次数、合并症（糖尿病、高血压、冠心病、呼吸衰竭）。
　　1.3.2 营养状态评估  采用Guigoz等[3]制定的MNA问卷对患者营养状态进行评估，MNA问卷分两个部分：营养筛检共6项内容，每项0～3分，一般评估共12项内容，每项0～2分，MNA问卷总计30分。总分≥24分营养状态良好;总分17～23分存在营养不良风险;总分<17分明确存在营养不良。
　　1.3.3 呼吸困难程度评估  采用Jones等[4]制定的CAT问卷及mMRC问卷对患者稳定期状态及呼吸困难进行评估。CAT问卷共8项，每项0～5分，总分0～40分，得分越高呼吸困难程度越严重。mMRC问卷：0级：仅在费力运动时出现呼吸困难;1级：平地快步行走或爬小坡时出现气短;2级：由于气短，平地行走比同龄人慢或需要停下;3级：在平地行走100 m左右或数分钟后需要停下来喘气来喘气;4级：因严重呼吸困难以至于不能离开家，或在穿衣服/脱衣服时出现呼吸困难。评定级别越高呼吸困难程度越严重。
　　1.3.4 肺功能评价  FEV1 患者最大深吸气后做最大呼气，最大呼气第一秒呼出的气量的容积，正常范围为男（3.18±0.12）L，女（2.31±0.05）L。FEV1%pred：FEV1和预计值的比值，轻度：≥80%;中度：50%～79%;重度：30%～49%;危重度：<30%。
　　1.3.5 血常规及血气分析  血常规：核酸荧光染色流式细胞术法检测白细胞、中性粒细胞及淋巴细胞计数。血气分析：玻璃电极选择性测定pH值，气敏电极直接测定Pa02，电化学法测定PaC02。
　　1.4 统计学方法
　　采用SPSS13.0统计软件，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，组间各指标的平均水平采用独立样本t检验或非参数检验。计数资料采用频数及百分比表示，两组间率的比较采用χ2检验。选取患者的临床资料、住院期间检查结果的相关变量进行单因素回归分析。单因素分析中具有统计学意义的因素再行多因素Logistic回归分析，P<0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 病毒检测
　　呼吸道病毒PCR检测阳性例数41例（41/107， 38.32%），病毒检出率依次为鼻病毒（HRV）9例（9/41， 21.95%）、甲型流感病毒（IVA）8例（8/41，19.51%）、副流感病毒3型（PIV3）6例（6/41，14.63%）、呼吸道合胞病毒A（RSVA）6例（6/41，14.63%）、人类偏肺病毒（HMPV）3例（3/41，7.32%）、副流感病毒1型（PIV1）3例（3/41，7.32%）、乙型流感病毒（IVB）3例（3/41， 7.32%）、腺病毒2例（ADV）（2/41，4.88%）、副流感病毒4型（PIV4）1例（1/41，2.44%）。见表1。
　　表1   病毒检出情况（n=41）
　　2.2 AECOPD患者基本资料比较
　　病毒阴性及阳性两组AECOPD患者资料，见表2。统计结果显示，两组患者在年龄、mMRC分级、营养状况、临床检测结果（血常规、血气分析、肺功能）等差异均无统计学意义（P>0.05）。
　　2.3 AECOPD患者呼吸道病毒感染危险因素分析
　　单因素结果显示，烟草暴露、糖尿病、呼吸衰竭、规律用药及1年内急性加重次数对AECOPD感染呼吸道病毒有统计学意义（P<0.05）。见表3。
　　病毒感染风险多因素Logistic回归分析：在α=0.05的水平上，得到1年内急性加重次数、烟草暴露、糖尿病、呼吸衰竭为COPD急性加重期患者病毒感染的危险因素（P<0.05），见表4。
　　表3   病毒阳性及病毒阴性组临床资料单因素分析[n（%）]
　　3 讨论
　　COPD的急性加重，是宿主、呼吸道病原体和环境污染之间复杂的相互作用。COPD患者的肺功能因疾病频繁发作而不断下降，细菌感染一直被认为是导致COPD病情恶化的主要原因;然而，随着聚合酶链反应检测呼吸道病毒的出现，人们已经认识到呼吸道病毒感染可能是COPD急性加重的主要原因[5]。早期的研究使用血清学和病毒培养技术，AECOPD患者病毒检出率在10%～30%[6]。随着PCR技术的应用，现在估计有一半的病情恶化与病毒有关[7]。Rohde G等[8]用聚合酶链反应技术，检测出56% AECOPD患者存在呼吸道病毒感染。
　　病毒诱导慢性阻塞性肺疾病急性加重的发病机制尚不确定，通过研究发现可能和以下机制有关：①呼吸道病毒会攻击气道上皮细胞，导致上皮细胞脱落、微血管扩张、水肿和免疫细胞浸润[9];②呼吸道病毒感染后可产生促炎细胞因子，包括IL-6（Interleukin 6）、IL-8（Interleukin 8）、肿瘤坏死因子-α、生长调节癌基因-α、干扰素-γ诱导蛋白10、细胞间粘附分子-1和中性粒细胞弹性蛋白酶，还能够激活表皮生长因子受体释放黏蛋白和IL-8[10]。细胞间粘附分子-1介导的病毒粘附气道上皮细胞[11]，促进病毒与气道上皮细胞的结合和进入气道上皮细胞;③病毒感染后细菌感染的易感性增加，黏液纤毛清除率降低[12]。
　　鼻病毒（Rhinovirus，HRV）是COPD急性加重期最常見的呼吸道病毒，MAllia P等[13]的人体实验模型表明，HRV能够诱发COPD急性加重：HRV感染可以引起COPD患者下气道微生物群的改变，并引起流感嗜血杆菌的致病趋势;鼻病毒可能通过减少痰液抗菌肽而降低COPD患者的先天免疫能力，增加细菌的易感性[14]。Singh M等[15]文献报道HRV编码的蛋白酶2A可诱导CD4+T细胞和单核细胞来源的树突状细胞活化Th1（helper T cell-1）和Th2（helper T cell-2），诱导COPD急性加重期患者病情加重。随后的Th2反应导致气道高反应性，并引发更严重的呼吸困难和加速肺功能恶化。 　　流感病毒則是AECOPD期间发现的另一种常见的呼吸道病毒[5]。与正常人相比，COPD患者在流感感染后的致死率增加。继发细菌性肺炎是流感流行病期间疾病发病率和死亡率的主要原因。其机制可能和流感病毒抑制机体针对肺炎链球菌的免疫反应，上调肺炎球菌粘附分子粘附气道上皮能力;流感也被证明能诱导中性粒细胞凋亡和中性粒细胞功能障碍[16]，并可能抑制巨噬细胞的吞噬功能[17]。
　　本研究发现HRV及流感病毒为COPD急性加重期常见呼吸道病毒，和国内一些研究结果相同[18]，呼吸道病毒分布具有季节差异性，本研究时间跨度2年，避免了季节分布的影响，但仍有局限性：本研究仅为单中心横断面研究，不能避免病毒地域分布不同造成的差异，且纳入例数较少，故验证结果需要多中心随机对照实验。
　　本研究结果还发现1年内急性加重次数、烟草暴露、糖尿病、呼吸衰竭与呼吸道病毒感染引起的COPD急性加重有着密切关联。吸烟本身为COPD危险因素，而糖尿病则使肺部感染的机率增加，通过相关研究发现这些危险因素均通过调节人体细胞免疫、体液免疫反应来降低对病毒的清除和防御能力[19]，对于危险因素的识别及预防将有效降低AECOPD发生率。
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　　（收稿日期：2019-10-17）
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