乳腺癌患者血浆微泡BCRP mRNA水平对化疗疗效的预测价值分析

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　　【摘要】 目的 分析乳腺癌患者血浆微泡乳腺癌耐药蛋白（BCRP）mRNA水平對化疗疗效的预测价值。方法 50例乳腺癌化疗患者作为观察组， 另选取同时间段进行体检的50例健康人作为对照组。对比两组研究对象的血浆微泡BCRP mRNA相对含量;对比观察组癌组织及癌旁健康组织的增殖基因Bcl-2、Survivin与凋亡基因Caspase-3、Caspase-9的mRNA含量;分析观察组血浆微泡BCRP含量与增殖基因Bcl-2、Survivin及凋亡基因Caspase-3、Caspase-9 mRNA的相关性。结果 观察组的血浆微泡BCRP mRNA相对含量为（255.42±35.17）， 显著高于对照组的（100.00±15.58）， 差异具有统计学意义 （P<0.05）。癌组织的增殖基因Bcl-2、Survivin的mRNA含量分别为（310.23±43.24）、（241.13±35.05）， 均显著高于癌旁健康组织的（100.00±13.31）、（100.00±15.11）， 凋亡基因Caspase-3、Caspase-9的mRNA含量分别为（35.07±4.05）、（25.54±3.02）， 均显著低于癌旁健康组织的（100.00±14.12）、（100.00±15.20）， 差异均具有统计学意义 （P<0.05）。血浆微泡中的BCRP mRNA含量与增殖基因Bcl-2、Survivin的mRNA含量呈正相关（r=0.748、0.714， P<0.05）， 与凋亡基因Caspase-3、Caspase-9的mRNA含量呈负相关（r=-0.785、-0.693， P<0.05）。结论 血浆微泡BCRP mRNA水平和乳腺癌化疗耐药性及发生存在相关性， BCRP mRNA含量水平越高则化疗效果越差， BCRP mRNA含量水平可作为预测化疗疗效的指标。
　　【关键词】 乳腺癌;乳腺癌耐药蛋白;化疗疗效;预测价值
　　DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.03.007
　　【Abstract】 Objective   To analyze the predictive value analysis of breast cancer resistant protein （BCRP） mRNA levels in plasma microbubble on the efficacy of chemotherapy of breast cancer patients. Methods   There were 50 patients with breast cancer treated with chemotherapy selected as the observation group， and another 50 healthy people who had physical examination in the same period selected as the control group. The relative content of BCRP mRNA in plasma microbubble was compared between the two groups， and the mRNA content of the proliferative genes Bcl-2， Survivin， and apoptotic genes Caspase-3， Caspase-9 in the cancer tissues and healthy tissues adjacent to the cancer of the observation group was compared. Correlation between BCRP content in plasma microbubble and proliferation genes Bcl-2， Survivin， apoptosis genes Caspase-3， Caspase-9 mRNA in the observation group were analyzed. Results   The relative content of BCRP mRNA in plasma microbubble was （255.42±35.17） in the observation group， which was significantly higher than （100.00±15.58） in the control group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The mRNA content of the proliferative genes Bcl-2 and Survivin in cancer tissues were （310.23±43.24） and （241.13±35.05）， which were significantly higher than those in healthy tissues adjacent to the cancer （100.00±13.31） and （100.00±15.11）. The mRNA contents of the genes Caspase-3 and Caspase-9 were （35.07±4.05） and （25.54±3.02）， which were significantly lower than （100.00±14.12） and （100.00±15.20） of healthy tissues adjacent to the cancer. Their differences was statistically significant （P<0.05）. The content of BCRP mRNA in plasma microvesicles was positively correlated with the mRNA levels of proliferating genes Bcl-2 and Survivin （r=0.748， 0.714， P<0.05）， and negatively correlated with the mRNA levels of apoptosis genes Caspase-3 and Caspase-9 （r=-0.785， -0.693， P<0.05）. Conclusion   There is a correlation between BCRP mRNA levels in plasma microbubble and the resistance and occurrence of chemotherapy in breast cancer. The higher the BCRP mRNA level， the worse the chemotherapy effect. The BCRP mRNA level can be used as an index to predict the efficacy of chemotherapy. 　　【Key words】 Breast cancer; Breast cancer resistant protein; Efficacy of chemotherapy; Predictive value
　　乳腺癌是临床较为多见的一种女性恶性肿瘤， 而手术切除联合生物治疗与化疗是目前最有效的治疗乳腺癌的方法， 其可防止肿瘤复发、延长患者生存时间及控制病情稳定[1]。但有部分患者在接受化疗时存在化疗药物耐药情况， 导致化疗效果并不理想。多药耐药至今仍是影响乳腺癌患者化疗疗效的一个主要原因， 明确多药耐药的根本原因与耐药过程中具有关键作用的因素是临床研究乳腺癌化疗的重点， 而BCRP和化疗耐药存在紧密关联[2， 3]。因此， 本文就此分析乳腺癌患者血浆微泡BCRP mRNA水平对化疗疗效的预测价值， 报告如下。
　　1 资料与方法
　　1. 1 一般资料 将2017年8月～2018年8月期间本院收治的50例乳腺癌化疗患者作为观察组， 另选取同时间段在本院进行体检的50例健康人作为对照组。对照组：年龄22～75岁， 平均年龄（47.5±9.3）岁; 体质量指数（BMI）20～27 kg/m2， 平均BMI（23.2±2.4）kg/m2。观察组：年龄21～77岁， 平均年龄（47.7±9.6）岁;BMI 20～26 kg/m2， 平均BMI（23.3±2.2）kg/m2。两组研究对象的年龄、BMI等一般资料比较， 差异无统计学意义（P>0.05）， 具有可比性。
　　1. 2 纳入及排除标准
　　1. 2. 1 纳入标准 ①所有研究对象均知情同意并签字且本次研究经本院伦理委员会批准。②观察组研究对象均经诊断为乳腺癌。
　　1. 2. 2 排除标准 ①有意识障碍者。②有精神病史者。
　　1. 3 方法
　　1. 3. 1 仪器与材料 RNA提取试剂由无锡百泰克生物技术有限公司提供;聚合酶链式反应（PCR）扩增与反转录试剂由赛默飞世尔科技（中国）有限公司提供（引物序列：R：5’- GACTGGATGAGGTCGTCCGTTTCC- 3’;F：5’- CAGCCGTGGAACTCTT TGGGTAGAGAAG-3’）;PCR仪购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司;Ultra SYBR Mixture（With ROX）由上海时代生物科技有限公司提供;小鼠抗BCRP单克隆抗体由北京百奥莱博科技有限公司提供;乳胶珠由无锡百泰克生物技术有限公司提供。
　　1. 3. 2 试验方法
　　1. 3. 2. 1 采集血浆微泡方法 所有研究对象于清晨空腹采集静脉血4 ml放置在EDTA抗凝管内， 再给予分离处理， 离心速度为3000 r/min， 持续3 min， 将磷酸盐缓冲液和血浆根据2∶1比例进行稀释， 然后以500 g进行离心10 min， 将细胞碎片去除， 2000 g进行离心30 min， 将血小板去除， 10000 g进行离心70 min完成沉淀获取。采取微量PBS（可取20 μl）溶解后保存于冰箱中（温度为-80℃）待用。
　　1. 3. 2. 2 采集肿瘤标本方法 观察组在术中进行乳腺癌组织与癌旁健康组织采集， 通过病理学检测明确受检组织性质后， 采取生理盐水对组织进行清洗， 于液氮中快速冷冻， 保存于冰箱中（温度为-80℃）。
　　1. 3. 2. 3 检测mRNA方法 将微泡及组织标准采用Trizol裂解液进行总RNA提取， 利用MMLV试剂盒完成反转录以获取cDNA标本， 再采取实时定量PCR法给予扩增， 扩增基因有Bcl-2、Survivin、Caspase-3、Caspase-9及BCRP， 以获取扩增曲线， 并计算mRNA相对含量。
　　1. 4 观察指标 ①对比两组研究对象的血浆微泡BCRP mRNA相对含量。②对比观察组癌组织及癌旁健康组织的增殖基因Bcl-2、Survivin与凋亡基因Caspase-3、Caspase-9的 mRNA含量。③分析观察组血浆微泡BCRP含量与增殖基因Bcl-2、Survivin及凋亡基因Caspase-3、Caspase-9 mRNA的相关性。
　　1. 5 统计学方法 采用SPSS19.0统计学软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验;计数资料以率（%）表示， 采用χ2检验;相关性检验采用Pearson相关分析。P<0.05表示差异具有统计学意义。
　　2 结果
　　2. 1 两组研究对象的血浆微泡BCRP mRNA相对含量对比
　　观察组的血浆微泡BCRP mRNA相对含量为（255.42±35.17）， 显著高于对照组的（100.00±15.58）， 差异具有统计学意义 （P<0.05）。见表1。
　　2. 2 观察组癌组织及癌旁健康组织的增殖基因Bcl-2、Survivin与凋亡基因Caspase-3、Caspase-9 mRNA含量对比
　　癌组织的增殖基因Bcl-2、Survivin的mRNA含量分别为（310.23±43.24）、（241.13±35.05）， 均顯著高于癌旁健康组织的（100.00±13.31）、（100.00±15.11）， 凋亡基因Caspase-3、Caspase-9的mRNA含量分别为（35.07±4.05）、（25.54±3.02）， 均显著低于癌旁健康组织的（100.00±14.12）、（100.00±15.20）， 差异均具有统计学意义 （P<0.05）。见表2。
　　2. 3 观察组血浆微泡BCRP含量与增殖基因Bcl-2、Survivin及凋亡基因Caspase-3、Caspase-9 mRNA的相关性 血浆微泡中的BCRP mRNA含量与增殖基因Bcl-2、Survivin的mRNA含量呈正相关（r=0.748、0.714， P<0.05）， 与凋亡基因Caspase-3、Caspase-9的mRNA含量呈负相关（r=-0.785、-0.693， P<0.05）。见表3。 　　3 讨论
　　对有潜在手术治疗机会的晚期局部乳腺癌患者来说， 术前给予化疗药物治疗可有效缩小转移淋巴结体积与原发肿瘤病灶， 从而使肿瘤TNM分期降低， 进而提高手术切除的完全性。而对行乳腺癌根治手术的患者来说， 术后给予生物靶向治疗与辅助化疗则可有效防止肿瘤复发、抑制微小病灶及延长生存时间[4， 5]。因此， 对乳腺癌患者采取综合治疗具有重要的改善其预后的临床价值， 但还存在部分患者的综合治疗效果未达到预期目标， 从而极易出现转移与复发情况， 造成此现象出现的原因主要是肿瘤细胞产生了针对化疗药物的耐药性， 导致癌细胞无法被化疗药物有效抑制[6， 7]。
　　如今， 乳腺癌患者化疗的多药耐药情况已受到临床高度重视， 有相关研究表明[8， 9]：乳腺癌患者化疗多药耐药情况的出现与多种基因异常表达存在紧密关联， 而BCRP就是一种耐药相关分子， 其处于细胞膜表面， 功能主要为介导细胞膜外与细胞膜内的药物转运， 可通过三磷酸腺苷（ATP）水解的能量将细胞内药物转运到细胞外， 从而完成转运过程。此过程可导致细胞内的药物浓度降低， 若细胞膜（癌细胞）存在大量BCRP， 则可致使化疗药物的浓度在癌细胞中大幅度下降， 从而达不到理想的杀伤效应， 最终形成癌细胞针对化疗药物的耐药性[10]。本文研究发现：观察组的血浆微泡BCRP mRNA相对含量为（255.42±35.17）， 顯著高于对照组的（100.00±15.58）， 差异具有统计学意义 （P<0.05）。提示血浆微泡BCRP mRNA相对含量的提高与发生乳腺癌存在紧密关联。微泡是大多细胞于病理或生理情况中均会分泌的一种微小囊泡总称， 其直径一般处于30～1000 nm之间， 包括外泌体、脱落小泡及微粒， 此也是一种重要的细胞间通讯间质， 具有细胞间遗传物质水平转移介导作用， 同时可使邻近细胞同享遗传物质， 最终达到组织中不同细胞与邻近细胞功能互相协调目的， 在研究肿瘤发病机制时， 血浆微泡已成为重点研究项目[11， 12]。由于乳腺癌患者常存在多药耐药情况， 致使化疗药物杀伤癌细胞的能力下降、对凋亡细胞的表达激活作用减弱及对增殖基因的表达抑制作用消失， 从而导致达不到理想的化疗效果[13， 14]， 故本文分析了癌组织及癌旁组织的增殖基因Bcl-2、Survivin与凋亡基因Caspase-3、Caspase-9 的mRNA含量关系， 结果提示：癌组织的增殖基因Bcl-2、Survivin的mRNA含量分别为（310.23±43.24）、（241.13±35.05）， 均显著高于癌旁健康组织的（100.00±13.31）、（100.00±15.11）， 凋亡基因Caspase-3、Caspase-9的mRNA含量分别为（35.07±4.05）、（25.54±3.02）， 均显著低于癌旁健康组织的（100.00±14.12）、（100.00±15.20）， 差异均具有统计学意义 （P<0.05）。本文研究亦发现：血浆微泡中的BCRP mRNA含量与增殖基因Bcl-2、Survivin的mRNA含量呈正相关（r=0.748、0.714， P<0.05）， 与凋亡基因Caspase-3、Caspase-9的mRNA含量呈负相关（r=-0.785、-0.693， P<0.05）。说明血浆微泡BCRP mRNA水平和乳腺癌化疗耐药性及发生存在相关性。
　　综上所述， 血浆微泡BCRP mRNA水平和乳腺癌化疗耐药性及发生存在相关性， BCRP mRNA含量水平越高则化疗效果越差， BCRP mRNA含量水平可作为预测化疗疗效的指标。
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　　[收稿日期：2019-11-08]
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