HBV感染患者外周血T淋巴细胞亚群水平及其与HBV-DNA载量的相关性研究

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　　 【摘要】 目的：探討外周血T淋巴细胞亚群在慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染患者检测中的价值及其与HBV-DNA载量的相关性研究，为评估HBV感染患者疾病进展及临床治疗提供参考依据。方法：选取2018年9月-2019年8月在浙江大学医学院附属第四医院就诊的103例HBV感染者作为试验组，按病情分为慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）组36例、乙肝肝硬化（liver cirrhosis，LC）组35例、乙肝病毒相关性原发性肝癌（hepatitis B virus-associated primary liver cancer，HBV-PLC）组32例;采用流式细胞术检测4组血清T淋巴细胞亚群表达水平，实时荧光定量PCR法检测3组试验组HBV-DNA定量，分析HBV载量与T淋巴细胞亚群相关性。结果：CHB组、LC组、HBV-PLC组CD3+、CD4+、CD4+/CD8+表达水平均低于对照组，CD8+表达水平高于对照组，CHB组CD3+、CD4+、CD4+/CD8+表达水平均高于LC组、HBV-PLC组，CD8+表达水平均低于LC组、HBV-PLC组，LC组CD4+、CD4+/CD8+表达水平均高于HBV-PLC组，CD8+表达水平低于HBV-PLC组，差异均有统计学意义（P<0.05）。高、低载量组CD3+、CD4+、CD4+/CD8+均低于HBV-DNA阴性组，高载量组CD4+、CD4+/CD8+均低于低载量组，差异均有统计学意义（P<0.05）。HBV感染者HBV-DNA载量与CD4+ T淋巴细胞表达水平存在负相关（r=-0.79，P<0.05），与CD8+T淋巴细胞表达水平存在正相关（r=0.73，P<0.05），与CD4+/CD8+及CD3+T淋T巴细胞表达水平无相关性（r=0.35、0.41，P>0.05）。结论：T淋巴细胞亚群比例在HBV感染患者中存在异常，可能成为HBV感染患者临床不良结局的预测因子，监测T淋巴细胞亚群对评估HBV感染患者免疫功能及临床治疗可提供一定指导意义。
　　 【关键词】 HBV感染 T淋巴细胞亚群 HBV-DNA载量 相关性
　　 doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2020.27.004 文献标识码 A 文章编号 1674-6805（2020）27-00-03
　　 [Abstract] Objective： To investigate the value of peripheral blood T lymphocyte subsets in the detection of patients with chronic hepatitis B virus （HBV） infection and their correlation with HBV-DNA load， so as to provide reference for the evaluation of disease progression and clinical treatment of patients with HBV infection. Method： A total of 103 patients infected with HBV who visited the Fourth Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine from September 2018 to August 2019 were selected as the experimental group. According to the condition， they were divided into the chronic hepatitis B （CHB） group with 36 cases， the liver cirrhosis （LC） group with 35 cases， hepatitis B virus-associated primary liver cancer （HBV-PLC） group with 32 patients. Flow cytometry was used to detect the expression level of serum T lymphocyte subsets in 4 groups， and real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect HBV DNA quantification in 3 test groups， and the correlation between HBV load and T lymphocyte subsets was analyzed. Result： The expression levels of CD3+， CD4+ and CD4+/CD8+ in CHB group， LC group and HBV-PLC group were all lower than those in the control group， and the expression level of CD8+ was higher than that in the control group， the expression levels of CD3+， CD4+ and CD4+/CD8+ in CHB group were all higher than those in LC group and HBV-PLC group， while the expression levels of CD8+ and CD4+/CD8+ in LC group in HBV-PLC group were all higher than those in HBV-PLC group， and the expression levels of CD8+ were lower than those in HBV-PLC group， the differences were statistically significant （P<0.05）. CD3+， CD4+ and CD4+/CD8+ in high load group and low load group were all lower than those in the HBV-DNA negative group， while CD4+ and CD4+/CD8+ in the high load group were all lower than those in the low load group， the differences were statistically significant （P<0.05）. HBV-DNA load was negatively correlated with the expression level of CD4+ T lymphocytes （r=-0.79， P<0.05）， and positively correlated with the expression level of CD8+ T lymphocytes （r=0.73， P<0.05）， and not correlated with the expression level of CD4+/CD8+ and CD3+ T lymphocytes （r= 0.35， 0.41， P>0.05）. Conclusion： The proportion of T lymphocyte subsets is abnormal in patients with HBV infection， which may be a predictor of adverse clinical outcomes in patients with HBV infection. Monitoring T lymphocyte subsets can provide certain guiding significance for the evaluation of immune function and clinical treatment in patients with HBV infection. 　　 [Key words] HBV infection T lymphocyte subsets HBV-DNA loads Correlation
　　 First-author’s address： The Fourth Affiliated Hospital of Zhejiang University Medical College， Yiwu 322000， China
　　 乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是DNA嗜肝病毒，感染人体后可造成肝细胞的损伤。多数为急性感染，主要表现为全身乏力，易疲劳，食欲不振或者黄疸等症状，少数患者因其免疫功能缺陷逐渐发展为慢性感染，HBV-DNA复制可进一步使患机体免疫系统功能紊乱，加重肝脏炎症反应及肝细胞的纤维化[1]，严重者可发展为肝硬化甚至肝癌等，甚至危及患者生命，我国乙型肝炎发病率接近50%，是原发肝癌的首要致病因素[2]。
　　 研究报道，免疫功能发生改变时，T淋巴细胞亚群比例会受到影响，因此T 细胞亚群被认为是免疫功能的评价指标[3]。人体感染HBV后，外周血淋巴细胞亚群数目和功能的改变预示各淋巴细胞亚群间的平衡被打破，而这种变化可反映机体的免疫状态的失衡[4]。本研究通过对HBV感染者T淋巴细胞亚群水平的测定，探讨HBV感染者不同疾病进程中T淋巴细胞亚群与疾病相关性及其与HBV-DNA载量的相关性，具体如下。
　　1 资料与方法
　　1.1 一般资料
　　 选取2018年9月-2019年8月在浙江大学医学院附属第四医院就诊的103例HBV感染者作为试验组，所有患者均符合文献[5]《慢性乙型肝炎防治指南（2015年）》中HBV感染的诊断标准。所有患者按病情分为慢性乙型病毒性肝炎（CHB）组36例、乙肝肝硬化（LC）组35例，乙肝病毒相关性原发性肝癌（HBV-PLC）组32例，以同期35例健康体检者作为对照组，HBV检测均为阴性且无肝病史。排除标准：合并其他类型肝炎、脂肪肝、酒精性肝病、伴有严重心、肾、肺疾病及肿瘤、免疫系统疾病等，以及妊娠、哺乳期妇女。CHB组男18例，女18例，平均年龄（54.29±4.98）岁;LC组男18例，女17例，平均年龄（53.34±5.48）岁;HBV-PLC组男17例，女15例，平均年龄（54.26±6.14）岁;健康对照组男17例，女18例，平均年龄（52.75±5.12）岁。各组研究对象性别、年龄差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。所有入组对象均签署知情同意书，并经医院医学伦理委员会批准。
　　1.2 方法
　　1.2.1 淋巴细胞亚群检测 抽取4组研究对象清晨空腹外周静脉血5 ml，其中2 ml使用EDTA-K2抗凝，采用美国BD公司流式细胞仪进行淋巴细胞亚群检测。
　　1.2.2 HBV-DNA检测 无菌采集试验组清晨、空腹血清标本2～3 ml，置入无菌离心管，室温保存2 h，1 600 r/min，离心5 min，吸取离心管中血清200 μl，将其转入1.5 ml无菌离心管中。取其中5 μl血清用于DNA提取。采用美国ABI-7300荧光定量PCR（荧光定量聚合酶链式反应）分析仪进行基因扩增，试剂购自湖南圣湘生物科技有限公司。结果判断：HBV DNA<102 copies/ml为阴性。
　　1.3 统计学处理
　　 选用SPSS 19.0统计软件进行处理。符合正态分布计量资料以（x±s）表示，采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，T淋巴细胞亚群与HBV-DNA相关性采用Pearson相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 试验组及对照组外周血T淋巴细胞表达水平比较
　　 CHB组、LC组、HBV-PLC组CD3+、CD4+、CD4+/CD8+表达水平均低于对照组，CD8+表达水平高于对照组，CHB组CD3+、CD4+、CD4+/CD8+表达水平均高于LC组、HBV-PLC组，CD8+表达水平均低于LC组、HBV-PLC组，LC组CD4+、CD4+/CD8+表达水平均高于HBV-PLC组，CD8+表达水平低于HBV-PLC组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。
　　2.2 HBV载量与T淋巴细胞亚群分析
　　 按HBV-DNA载量将试验组分为HBV-DNA阴性组（HBV-DNA<102 copies/ml，26例）、低载量组（HBV-DNA≥102 copies/ml且<105 copies/ml，41例）及高载量组（HBV-DNA≥105 copies/ml，36例）。
　　2.2.1 不同HBV-DNA载量患者淋巴细胞亚群水平比较 高、低载量组CD3+、CD4+、CD4+/CD8+均低于HBV-DNA阴性组，高载量组CD4+、CD4+/CD8+低于低载量组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表2。
　　2.2.2 HBV载量与T淋巴细胞亚群的相关性分析 HBV感染者HBV-DNA载量与CD4+ T淋巴细胞表达水平存在负相关（r=-0.79，P<0.05），与CD8+T淋巴细胞表达水平存在正相关（r=0.73，P<0.05），与CD4+/CD8+及CD3+T淋T巴细胞表达水平无相关性（r=0.35、0.41，P>0.05）。
　　3 讨论
　　 有學者研究发现，人体感染HBV后，病毒不会直接造成肝脏的损伤，肝脏损伤与其介导的免疫损伤有关，HBV抗原引起的免疫应答与病情发展、抗病毒治疗停止后病毒的反跳均有密切关联，而T淋巴细胞在机体感染HBV后所产生的免疫应答中发挥着至关重要的作用，因此T淋巴细胞水平的变化在一定程度上反映了机体的免疫水平[6]。机体感染病毒后，其免疫状态可通过CD3+ T淋巴细胞反映，CD4+ T淋巴细胞在免疫应答中起到清除病毒发挥中心的作用，CD8+T 淋巴细胞激活和抑制依赖CD4+ T淋巴细胞，表现为CD4+/CD8+比值倒置[7]。 　　 张健[8]报道乙型肝炎病毒患者的CD4+、CD4+/CD8+低于健康体检者;孙凯凯等[9]研究发现，HBV感染者免疫功能指标均低于健康人群，其中慢乙肝组免疫功能指标均高于肝硬化组和急慢性肝衰竭组。本研究结果显示，与对照组相比，CHB 组、LC组、HBV-PLC组CD3+、CD4+表达水平及CD4+/CD8+均显著降低，CD8+表达水平均显著升高，差异均有统计学意义（P<0.05），也就是在肝炎、肝硬化、肝癌这一系列疾病发生及发展中，CD3+、CD4+表达水平逐渐降低，CD8+表达水平逐渐升高。提示机体感染HBV后，T淋巴细胞亚群表达水平紊乱，从而导致机体细胞免疫功能下降，随着患者疾病进展，T淋巴细胞亚群紊乱程度加重。
　　 杨茜等[10-12]在比较HBV感染者T淋巴细胞亚群表达水平与HBV-DNA载量相关性时发现，随着患者HBV-DNA载量的提高，CD3+、CD4+T淋巴细胞百分比都有下降的趋势，而CD8+T淋巴细胞的百分比呈现逐步增加，进而CD4+/CD8+的比值也随着病毒载量的增加而降低。本研究发现高、低HBV-DNA载量组CD3+、CD4+、CD4+/CD8+均低于阴性组，高载量组CD4+、CD4+/CD8+均低于低载量组，差异均有统计学意义（P<0.05）。HBV感染者HBV-DNA载量与CD4+ T淋巴细胞表达水平存在负相关（r=-0.79，P<0.05），与CD8+ T淋巴细胞表达水平存在正相关（r=0.73，P<0.05），与CD4+/CD8+及CD3+T淋T巴细胞表达水平无相关性（r=0.35、0.41，P>0.05）。上述研究都证实了HBV的复制会影响患者T细胞亚群的表达水平，导致免疫功能紊乱，分析其机制可能为机体感染HBV后，HBV-DNA复制，损耗大量CD4+ T淋巴细胞，而抗原慢性刺激致CD8+ T淋巴细胞表达增加，此HBV感染者免疫功能低于健康体人群。
　　 综上所述，机体感染HBV后，体内免疫系统功能发生紊乱，特别是外周血T淋巴细胞亚群比例失衡，而HBV-DNA的高复制可使T细胞亚群的失衡进一步加重。因此监测HBV感染者淋巴细胞亚群对于评估其免疫功能及疾病进展方面，可能具有重要的临床应用价值。
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　　（收稿日期：2020-03-31） （本文编辑：马竹君）
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