侧沟爬岩鳅人工繁殖和胚胎发育初步研究

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　　摘要：2017年6月至2018年4月，在大渡河黑马鱼类增殖站进行了侧沟爬岩鳅（Beaufortia liui）的人工繁殖和胚胎发育初步研究。结果表明，侧沟爬岩鳅为底栖、杂食性鱼类，昼伏夜出。其繁殖季节为2—4月，成熟卵呈卵圆形，卵径约0.8 mm，淡黄色，微黏性。受精后约15 min卵膜吸水膨胀至最大，卵径约1.2 mm。在水温（17±0.5） ℃下历时60 h 55 min，积温974.56 ℃·h，经过7个阶段完成胚胎发育。仔鱼出膜6 d开口，出膜45 d，仔鱼的胸鳍和腹鳍完全特化，其体型与成鱼基本相同。
　　关键词：侧沟爬岩鳅（Beaufortia liui）;人工繁殖;胚胎发育;大渡河
　　中图分类号：S966.4         文献标识码：A
　　文章编号：0439-8114（2019）24-0150-04
　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.22.036           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　Preliminary study on artificial reproduction and embryo development of Beaufortia liui
　　TAN Gang1，WU Yi1，HE Xing-heng1，AN Yi-min2，CHEN Fan-gang1
　　（1.Sichuan Aquabase Biotechnology Co.，Ltd.，Chengdu 610000，China;
　　2.Guodiandaduhezhentouba Hydropower Construction Co.，Ltd.，Leshan 614700，Sichuan，China）
　　Abstract： From June 2017 to April 2018， Experiment of artificial reproduction embryo development of Beaufortia liui in the Dadu river black horse fish breeding station. The results showed that it was omnivorous fish and benthic like nocturnal. The breeding season was from February to April， the mature eggs were oval， the egg diameter was about 0.8 mm， and the yellowish， slightly sticky. About 8 minutes after fertilization， the egg membrane swelled to the maximum， and the egg diameter was about 1.2 mm. At a water temperature of （17±0.5） ℃ for 60 h 55 min， the accumulated temperature of 974.56 ℃·h. Embryo development was completed in seven stages. After 6 days， the seedlings began to eat. The pectoral and ventral fins of the larvae were completely specialized after 45 d of film emergence， and their body shape was basically the same as that of adult fish.
　　Key words： Beaufortia liui; artificial reproduction; embryonic development; Dadu river
　　側沟爬岩鳅（Beaufortia liui）属于鲤形目（Cypriniformes）爬鳅科（Balitoridae）爬岩鳅属（Beaufortia），主要分布于岷江、大渡河及金沙江流域[1]。随着人类活动的增加、水利工程的修建、生态环境的破坏等因素，致使侧沟爬岩鳅的生境分布区域和野外生物量逐年减小。目前，有关侧沟爬岩鳅的研究仅有其形态分类的文献记载[1，2]。本研究于2017年6月至2018年4月，对侧沟爬岩鳅的人工繁殖和胚胎发育进行了初步研究，旨在探索侧沟爬岩鳅的人工繁殖和胚胎发育规律，为小型爬鳅科鱼类的研究提供基础资料。
　　1  材料与方法
　　1.1  亲鱼的驯养与培育
　　本研究所用的侧沟爬岩鳅亲鱼采集于大渡河和金沙江流域，共采集到680尾野生亲鱼。野生亲鱼在室内的仿生驯养池进行驯养，驯养分为三个阶段进行：第一阶段，主要进行野生亲鱼投喂开口饵料的驯养;第二阶段，主要进行饲喂人工合成饵料的驯养;第三阶段，主要进行人工环境适应性的驯养。
　　通过3～4个月的人工驯养，侧沟爬岩鳅可在室外进行亲鱼强化培育。选择体表无伤、体重1.2 g以上雄鱼和2.0 g以上的雌鱼作为后备亲鱼进行培育。将后备亲鱼投放到室外水泥池中进行培育，池底铺一层鹅卵石，用流水养殖，养殖密度为10尾/m2。每天定时观察其生活习性和生长状况，做好残余饵料和排泄物的处理，并及时进行病害预防。日常驯养培育时，控制鱼池的进水量为0.3 m/s，pH为6.7～7.8、溶解氧为10.5～12.0 mg/L、水温为15～20 ℃。 　　1.2  人工繁殖
　　依据侧沟爬岩鳅的繁殖生物学测定数据，每尾雌鱼平均重量为3.5 g。用3.5%的生理盐水配制催产剂，催产剂量为HCG 100～300 IU+LHRH-A2 6～10 μg/kg。采用一针注射法，从胸鳍基部靠近腹腔处以45°注射催产药物，进针深度约为0.10 cm;雌鱼注射10 h 后，给雄鱼注射催产药物，催产剂量减半。注射完后，将亲鱼放回暂养池内，保持水温（17.0±0.5） ℃，控制水流速度0.3 m/s。
　　雌鱼注射药物10 h后，定时检查，当轻轻挤压雌鱼腹部有卵从泄殖孔中顺利流出即可挤卵;以纸巾擦拭尾部表面多余的水分，将成熟的卵挤入干燥的培养皿中。轻轻挤压雄鱼腹部从泄殖孔有乳白色精液流出，用生理盐水将其冲洗到盛有卵子的培养皿中，并轻轻用手晃动培养皿10～15 s后静置30 s，获得受精卵。将受精卵平铺在烧杯中，再将烧杯放置在玻璃鱼缸中进行孵化，控制水温在（17±0.5） ℃，保持微流水。
　　1.3  胚胎和仔鱼发育观察
　　用XTZ-EAS体视解剖镜对侧沟爬岩鳅胚胎发育进行观察。用华谷动力相机Demo Cam软件收集胚胎发育各个时期的照片及录像。仔鱼发育采用尼康单反相机（D7100）和微距镜头（Tamron SP AF 90 mm F/2.8）进行定时观察拍摄记录。胚胎发育和仔鱼发育水温为16～18 ℃。
　　胚胎发育的积温（℃·h）=胚胎发育时间（h）×发育时水温（℃）[3]。
　　2  结果与分析
　　2.1  生活习性与繁殖特性
　　侧沟爬岩鳅为底栖、杂食性鱼类，昼伏夜出，应急反应敏捷。白天多隐藏在鹅卵石下或阴暗处的水泥池壁上，借助其特化的胸鳍和腹鳍吸附在卵石和鱼池壁的表面。20：00左右开始出来活动觅食，此时侧沟爬岩鳅能够快速敏捷在水体中游动。觅食时依靠胸鳍匍匐前进，利用其角质化的下颌刮食固着的藻类和捕捉水体底层及水草周围的无脊椎动物，如摇蚊幼虫和水蚯蚓等。在动物性食物充足时偏食无脊椎动物，仅采食少量藻类;当动物性食物匮乏时，就采食藻类植物。
　　根据野外调查和人工驯养的观察，侧沟爬岩鳅的繁殖季节为2—4月，且不同流域其繁殖时间略有不同。金沙江流域，其繁殖时间为2—3月;大渡河流域，其繁殖时间在3—4月。侧沟爬岩鳅的成熟卵呈卵圆形，卵径约0.8 mm，淡黄色。受精卵具微黏性，其黏性随时间逐渐消失;受精卵遇水后卵膜径约1.2 mm，卵粒中不含油粒，在静水或微流水环境中多数会沉入水底，少部分吸附在容器壁上，并且卵粒之间不相互黏连，当有稍强流水冲击的情况下会随着水流而动，使卵表面容易黏附杂质和小气泡。
　　2.2  胚胎发育
　　侧沟爬岩鳅胚胎发育在（16～18） ℃下历时60 h 55 min，积温974.56 ℃·h。侧沟爬岩鳅胚胎发育过程与其他鲤科鱼类相同，经过7个阶段，胚胎发育时序见表1、图1。
　　2.2.1  胚盘隆起期  受精后10 min，受精卵逐渐吸水膨胀;受精后23 min，卵膜径达到最大;35 min后，受精卵原生质逐渐向着动物极移动，卵黄向着植物极移动，胚盘形成;1 h 14 min后胚盘达到最大，高度约占卵黄的1/5～1/4。
　　2.2.2  卵裂期  1 h 52 min后，受精卵胚盘开始进行第一次分裂，从细胞中间开始径向分裂，并形成两个细胞，进入2细胞期;2 h 36 min后，胚盘开始进行第二次分裂，与第一次分裂方向垂直，分裂4个细胞，进入4细胞期;3 h 05 min后，胚盘开始发生第三次分裂，分裂方向与第一次分裂平行，分裂成2排，每排4个细胞，下边4个细胞略大于上边4个，进入8细胞期;5 h 48 min后，胚盘开始发生第四次分裂，分裂方向与第二次分裂平行，分裂成排成4排，每排4个细胞，中间4个细胞略微大于周圍的细胞，并进入16细胞期;6 h 40 min后，胚盘发生第五次分裂，分裂方向与第一次分裂平行，分裂成4排，每排8个大小相似的细胞，进入32细胞期;随着细胞分裂的不同步，细胞层数开始堆叠，数目逐渐增多、大小逐渐减小，8 h 12 min后，进入桑葚胚期，胚盘的一端开始逐渐形成隆起的多细胞胚体，如同桑葚，故称为桑葚胚期。
　　2.2.3  囊胚期  10 h 10 min后，胚体细胞逐渐分裂使细胞层在卵黄上部明显隆起，囊胚高度约占卵黄的1/2，受精卵进入囊胚早期;11 h 30 min后，胚层高度降低、开始向卵黄周围进行移动，开始形成囊胚腔，受精卵进入囊胚中期;13 h 12 min后，胚层开始下包、高度逐渐降低，细胞层在卵黄上的隆起变得不再明显，受精卵进入囊胚晚期。
　　2.2.4  原肠胚期  15 h 05 min后，开始出现胚环，胚层开始下包约1/3，侧面可见胚层细胞背唇呈新月状，胚盘边缘伴随着胚层细胞内卷形成胚环，受精卵进入原肠早期;受精后17 h 35 min，胚层向下包裹至卵黄的1/2，此时在胚环的一定部位内卷形成三角形隆起，受精卵进入原肠中期。受精后19 h 15 min，胚层细胞向下包裹至卵黄的2/3，背唇逐渐明显，开始形成胚体，此时受精卵进入原肠晚期。
　　2.2.5  神经胚期  21 h 20 min后，胚层细胞继续向下包裹至卵黄的3/4至5/6以上，进入神经胚期;随着胚层细胞继续向下包裹;23 h 35 min后，胚孔彻底闭合，胚胎背面开始形成神经版，受精卵进入胚孔封闭期;26 h 18 min后，开始出现柱状的脊索，并逐渐形成胚体。
　　2.2.6  器官形成期  30 h 30 min后，胚体头部明显凸起，形成脑泡，脑泡的两侧出现一对椭圆隆起，为眼的原基，受精卵进入眼基出现期。 　　2.2.7  出膜前期  60 h 55 min后，受精卵进入出膜期，出膜时胚体尾部先破膜而出，头部还留在卵膜内，随后卵膜逐渐塌陷，幼苗开始脱落，在容器底部摆动，具有较大的卵黄囊。68 h 15 min后，所有受精卵完成脱膜。
　　2.3  仔鱼发育
　　刚出膜仔鱼通体透明无色素积累，卵黄囊前段膨大呈圆球状，后段呈长细棒状紧贴鱼体腹部，卵黄囊全长约占仔鱼全长的3/4;初孵仔鱼，大部分在容器底部平躺，时而依靠尾部摆动。
　　仔鱼出膜后3 d，开始出现胸鳍，细长紧贴在鱼体两侧，心脏跳动明显，血液透明且涌动明显。
　　仔鱼出膜后6 d，仔鱼的卵黄囊基本吸收完毕。仔鱼头部和背部出现大量的黑色素，心脏和血管隐约可见，开始靠尾部摆动在容器底部游动但范围较小，胸鳍发育快速呈扇叶状，开始取食煮熟的鸡蛋黄粒。
　　仔鱼出膜后8 d，仔鱼胸鳍发育成长条形，背鳍、腹鳍开始发育，仔鱼身体黑色素明显。当有外界刺激时，依靠胸鳍和尾鳍在容器底部游动，游动范围小且主要在水体底部游动，开始主动取食幼体轮虫和幼体枝角类。
　　仔鱼出膜后15 d，仔鱼的胸鳍和腹鳍还未特化。仔鱼呈现头部大，身体细长，当有外界刺激时主要沿着容器壁游动，开始取食稍大的枝角类和藻类。
　　仔鱼出膜后25 d，仔鱼的胸鳍和腹鳍还未完全特化。仔鱼体色呈现淡黄色或青色，头后身体逐渐变宽，呈梭形，并开始匍匐于卵石和容器壁上。
　　仔鱼出膜后45 d，仔鱼的胸鳍和腹鳍完全特化，身体上的斑纹明显，体型与成鱼基本相同。侧沟爬岩鳅仔鱼发育过程见图2。
　　3  讨论
　　与已报道的其他爬鳅科鱼类相同，侧沟爬岩鳅的受精卵属于漂流性卵[4]。但侧沟爬岩鳅的卵径（1.2 mm）要小于犁头鳅（5.34 mm）[5]和四川华吸鳅（1.85 mm）[6]，并且黏性也比犁头鳅和四川华吸鳅弱。
　　影响侧沟爬岩鳅胚胎发育的主要因素是水温。整个发育过程中需要保持水温在16～18 ℃，受精卵经过60 h 55 min胚胎发育，开始出膜。在水温16～18 ℃范围内侧沟爬岩鳅的受精卵出膜率达到最高，畸形率最低，幼苗出膜后，存活率较高;当水温在19～22 ℃时，胚胎发育到囊胚期用时较短，但开始出现大量死亡，出膜率较低并且畸形苗出现较高;当水温小于16 ℃时，胚胎进入原肠胚期时就开始出现大量死亡，出膜率最低。本研究表明侧沟爬岩鳅在水温16～18 ℃时，较为适合其正常的胚胎发育。吴金明等[6]对赤水河四川华吸鳅的胚胎发育进行了研究，表明其在水温26.3～27.8 ℃下，受精卵经过22 h 34 min的胚胎发育，开始出膜，仔鱼经过65 d发育成成鱼体型;熊玉宇等[5]对犁头鳅的胚胎发育进行了研究，表明其在水温26.3～27.8 ℃下，受精卵经过34 h的胚胎发育，开始出膜，仔鱼经过56 d发育成成鱼体型。李恒德[7]對金沙江犁头鳅的胚胎发育研究表明，其在水温17.5～21.0 ℃下，受精卵经过57 h 48 min的胚胎发育，开始出膜。大渡河侧沟爬岩鳅的胚胎发育时间与金沙江犁头鳅较为接近，胚胎发育温度范围却比其要窄，并且侧沟爬岩鳅仔鱼发育的速度要快于四川华吸鳅和犁头鳅，这可能与侧沟爬岩鳅生存环境、水流、溶解氧以及卵黄的大小等因素有关。
　　参考文献：
　　[1] 丁瑞华.四川鱼类志[M].成都：四川科学技术出版社，1994.
　　[2] 陈宜瑜.中国平鳍鳅科鱼类系统分类的研究I.平鳍鳅亚科鱼类的分类[J].水生生物学集刊，1978（3）：331-348.
　　[3] 薛凌展.大刺鳅胚胎发育观察[J].淡水渔业，2014，44（2）：101-104，108.
　　[4] 唐文乔，陈宜瑜.平鳍鳅科鱼类的分类学研究[J].上海水产大学学报，2000（1）：1-10.
　　[5] 熊玉宇，乔  晔，刘焕章，等.犁头鳅早期发育[J].水生生物学报，2008（3）：424-433.
　　[6] 吴金明，王芊芊，刘  飞，等.赤水河四川华吸鳅的早期发育[J].四川动物，2011，30（4）：527-529，536，670.
　　[7] 李恒德.金沙江贡氏犁头鳅的繁殖和胚后发育的观察[J].动物学杂志，1965（2）：79-83.
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