工程大肠杆菌高效转化外源脂肪酸生成羟基脂肪酸的研究

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　　摘要：细胞色素P450单加氧酶（P450BM3）能特异性催化脂肪酸ω碳位羟基化反应生成羟基脂肪酸，在前期构建携带单加氧酶基因P450BM3工程大肠杆菌（Escherichia coli）转化脂肪酸的基础上，为解决外源脂肪酸在羟基化过程中的消耗和转运问题，构建了脂酰基辅酶A合成酶基因（fadD）缺失和外膜蛋白编码基因（fadL）过表达的工程菌株。摇瓶条件下羟基十二酸产量达到748.8 mg/L，转化率为93.6%。
　　关键词：脂酰辅酶A合成酶;外膜蛋白编码基因;羟基脂肪酸;重组大肠杆菌（Escherichia coli）
　　中图分类号：TS206.4         文献标识码：A
　　文章编号：0439-8114（2020）01-0152-04
　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.01.035           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　Abstract： Cytochrome P450BM3 can hydroxylates fatty acids into hydroxyfatty acids（HFAs） at the ω-positions with high entioselectivity. Based on the construction of Escherichia coli carrying P450BM3 gene to transform fatty acids. As an effort to solve inhibit fatty acid β-oxidation and increase outer membrane fatty acids transporter， the lipoacyl-coa synthase gene（fadD） deletion and outer membrane proteins encode gene（fadL） overexpression strains were built. Under shake-flask conditions， this recombinant strains produced 748.8 mg/L hydroxy dodecanoic acid， meanwhile the conversion rate was 93.6%.
　　Key words： lipoacyl-coa synthase gene（fadD）; outer membrane proteins encode gene（fadL）; hydroxy fatty acid; recombinant Escherichia coli
　　羥基脂肪酸是合成假神经酰胺、聚酯以及内酯的重要前体[1-3]，其中，ω-羟基脂肪酸由于羟基位于首位碳链端，可为聚合物材料合成提供最长碳链，是生物可降解材料研究开发中最理想的原料之一[4-6]。由于传统化学合成的局限性，微生物合成羟基脂肪酸已成为近年来的研究热点[7]。
　　微生物转化脂肪酸合成羟基脂肪酸具有转化效率低的特点[8]，为提高外源脂肪酸转化率和羟基脂肪酸产量，引入增加胞外脂肪酸转运量和降低菌体β氧化途径的策略，通过敲除脂酰基辅酶A合成酶基因（fadD）阻断脂肪酸β氧化途径[9，10]，以增加底物脂肪酸浓度;过表达大肠杆菌（Escherichia coli）外膜蛋白编码基因（fadL），增大外源脂肪酸转运量[11，12]。通过对重组菌发酵条件的优化，有效提高了外源脂肪酸转化率和ω-羟基脂肪酸产量。
　　1  材料与方法
　　1.1  材料
　　1.1.1  菌株、质粒和引物  Escherichia coli BL21 （DE3）和Escherichia coli DH5α，Invitrogen公司;菌株Bacillus megaterium 14581、Escherichia coli K-12、质粒pET-28a（+）和pACYCDuet-1，Novagen公司。
　　工程菌Escherichia coli BL21（DE3）+pACYCDuet-1-P450BM3记作WX1;Escherichia coli BL21（DE3）△fadD+pACYCDuet-1-P450BM3，记作WX2;Escherichia coli BL21（DE3）△fadD+pACYCDuet-1-P450BM3+pET-28a（+）-fadL，记作WX3。3种工程菌株由山东大学（威海）海洋学院实验室构建并保藏。菌株WX1携带质粒pACYCDuet-1，质粒上携有脂肪酸羟化酶基因P450BM3，菌株WX2、WX3为fadD基因敲除型，质粒pET-28a（+）携带fadL基因。本研究所用菌株、质粒及引物见表1。
　　1.1.2  试剂与培养基  Pyrobest DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、dNTP、感受态细胞，Takara公司;限制性内切酶及胶回收试剂盒，质粒提取试剂盒等，生工生物工程（上海）股份有限公司;十二酸（月桂酸）、10-羟基癸酸、卡那霉素、氯霉素、胰蛋白胨、酵母提取物及IPTG等，中国医药集团有限公司。其余试剂均为国产分析纯。
　　LB液体培养基（g/L）：蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，pH 7.0。
　　M9发酵培养基（g/L）：葡萄糖20，磷酸氢二钠6，磷酸二氢钾3，氯化铵1，氯化钠0.5，硫酸镁0.12。
　　1.1.3  仪器与设备  Aglient 7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪，Aglient Technologies公司;LDZM-80KCS型蒸气灭菌器，驰通仪器（上海）有限公司;ZHWY-1102B恒温摇床，上海申安医疗器械厂;Neofuge15R型冷冻离心机，力新仪器（上海）有限公司。 　　1.2  方法
　　1.2.1  发酵条件  构建的工程菌株以1∶100的比例转接至500 mL M9培养基摇瓶中，菌株WX1和WX2培养时加入终浓度34 mg/L氯霉素，菌株WX3添加终浓度34 mg/L氯霉素和50 mg/L卡那霉素。恒温摇床振荡培养至菌体OD600 nm为2.0，加入IPTG（0.1 mmol/L）诱导基因表达，为增加蛋白表达活性，培养温度降为30 ℃，以利于蛋白表达[13]。在菌体培养至指数后期，菌体用0.2 mol/L磷酸钾缓冲液（pH 7.4）配成菌悬液，添加葡萄糖（0.5%）和脂肪酸进行全细胞催化反应。
　　1.2.2  代谢产物处理与分析  产物处理及检测参考文献[14]，离心收集发酵液上清，6 mol/L盐酸调节pH至2.0，利用等体积氯仿抽提，抽提液加入甲酯化试剂（H2SO4/CH3OH）于60 ℃水浴酯化反应20 min后，等体积正己烷萃取。利用Aglient 7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪对产物进行定量和定性，以10-羟基癸酸为内标进行定量。
　　转化率=ω-羟基脂肪酸产量/外源脂肪酸添加量×100%
　　代谢产物分析色谱条件为HP-5毛细管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）;升温程序为起始80 ℃，持续2 min，5 ℃/min升温至250 ℃，保持10 min。加样器和检测器温度分别为250 ℃和300 ℃。
　　质谱条件为电子轰击（EI）离子源，离子能量70 eV，离子源温度220 ℃;扫描模式为全扫描;质量扫描范围m/z为10～600。
　　2  结果与分析
　　2.1  fadD基因缺失对羟基脂肪酸产量的影响
　　大肠杆菌脂肪酸β氧化途径过程会消耗脂肪酸[15]，因此在羟基脂肪酸的合成途径中敲除脂酰基辅酶A合成酶基因，可以减少羟化底物的消耗，增加羟基脂肪酸产量。在P450单加氧酶（P450BM3）成功表达的基础上，为验证fadD基因缺失对羟基脂肪酸产量的促进作用，分别将重组菌WX1和WX2接种至M9基本培养基中，添加1 mmol/L十二酸测定细胞羟基脂肪酸产量的变化情况。摇瓶试验结果表明，菌株WX2发酵后羟基十二酸产量为163.8 mg/L（转化率81.9%），是对照菌株WX1产量的1.9倍（图1）。表明在Escherichia coli中敲除脂酰基辅酶A合成酶后，对羟基脂肪酸产量有了明显的促进作用，提高了Escherichia coli羟基脂肪酸合成能力。
　　2.2  fadD基因缺失和fadL基因过表达对羟基脂肪酸产量的影响
　　为进一步验证fadL基因过表达对羟基脂肪酸产量的影响，分别将重组菌WX2和WX3接种至M9基本培养基中，添加1 mmol/L十二酸测定HFAs的产量。在摇瓶条件下，经GC检测，菌株WX3发酵后羟基十二酸产量为189.4 mg/L（转化率94.7%），是WX2菌株产量的1.2倍（图1）。表明在Escherichia coli中过表达大肠杆菌fadL基因，有利于提高脂肪酸转化率和菌株羟基脂肪酸产量，是提高Escherichia coli羟基脂肪酸合成能力的有效途径。
　　2.3  底物十二酸濃度对羟基脂肪酸产量和转化率的影响
　　为更进一步提高羟基脂肪酸（HFAs）产量，对底物十二酸不同浓度进行了研究，在浓度为1～5 mmol/L，菌株WX3浓度为1～4 mmol/L时产量随浓度增加而增加，底物转化率维持在较高的水平（>90%），在4.0 mmol/L时羟基十二酸产量达到最大值748.8 mg/L（转化率93.6%）（图2）。然而随着底物浓度增大，羟基脂肪酸产量和底物转化率降低，在浓度为5 mmol/L时产量仅为529.9 mg/L（转化率26.8%），原因可能是随底物脂肪酸浓度增大引起酶失活或对细胞有毒害作用[16]，导致羟基脂肪酸产量和底物转化率的降低。
　　2.4  fadD基因缺失和fadL基因过表达对羟基脂肪酸组成的影响
　　通过GC-MS方法对菌株WX1和WX3产物组成进行定量分析，结果如图3所示。工程菌株WX1和WX3产物均含有3种羟基脂肪酸，分别为ω-1羟基十二酸、ω-2羟基十二酸和ω-3羟基十二酸。其中，ω-1羟基十二酸在两种工程菌种产物中所占比例最高，在40.7%～43.7%，无明显差异。产物ω-2羟基十二酸和ω-3羟基十二酸所占比例差别不大，分别为31.1%、28.3%和27.5%、28.8%。表明fadD基因缺失和fadL基因过量表达仅影响羟基脂肪酸产量而不影响其种类和组成。
　　3  小结与讨论
　　研究的目的是构建能高效转化外源脂肪酸生成羟基脂肪酸的菌株，在试验中构建了敲除大肠杆菌脂酰基辅酶A合成酶基因和过表达外膜蛋白编码基因的菌株以提高羟基脂肪酸的产量，经发酵条件优化后，基因工程菌株WX3羟基十二酸产量为189.4 mg/L，转化率为94.7%，相比原始菌株产量（82.4 mg/L）和转化率（41.2%）均有较大的提高。增加底物浓度至4 mmol/L，羟基十二酸产量达748.8 mg/L（转化率93.6%），代表了生物转化脂肪酸生成羟基脂肪酸的一个较高水平。在今后的研究中，通过寻找反应性更强的羟化酶以及对大肠杆菌进行进一步代谢工程改造，羟基脂肪酸产量有望得到进一步的改善和提高。
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