叠氮溴化丙锭-羟基萘酚蓝-环介导等温扩增法检测畜禽肉中单核细胞李斯特菌

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　　摘 要：将叠氮溴化丙锭（propidium monoazide，PMA）、羟基萘酚蓝（hydroxynaphthol blue，HNB）与环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術相结合，建立一种可视化PMA-HNB-LAMP方法快速检测畜禽肉中单核细胞李斯特菌（Listeria monocytogenes）。结果表明，当PMA终质量浓度为5.0 μg/mL、孵育和曝光时间均为15 min时，可有效抑制105 CFU/mL的单核细胞李斯特菌死菌DNA的聚合酶链式反应扩增，而对活菌DNA的扩增不具有抑制作用。LAMP反应体系中HNB终浓度为210 μmol/L时，检测显色结果肉眼可见。该方法的纯菌液灵敏度为2.4×102 CFU/mL，人工污染肉制品的检出限为2.3×104 CFU/ mL。分别采用国标法、PMA-HNB-LAMP法和HNB-LAMP法检测20 份市售畜禽肉样，3 种方法的单核细胞李斯特菌检出率分别为5%、10%和20%。PMA-HNB-LAMP法在一定程度上可解决LAMP法的假阳性问题，并且具有操作简单、可视性强的优点。
　　关键词：单核细胞李斯特菌;叠氮溴化丙锭;羟基萘酚蓝;环介导等温扩增;畜禽肉
　　Abstract： Using propidium monoazide （PMA） treatment and hydroxynaphthol blue （HNB） staining combined with loop-mediated isothermal amplification， a rapid and visual detection method （PMA-HNB-LAMP） for Listeria monocytogenes was established in this study. The optimization of experimental parameters showed that a final PMA concentration of 5.0 μg/mL， incubation time of 15 min and exposure time of 15 min could restrain DNA amplification of 105 CFU/mL dead cells but not of live cells. A final HNB concentration of 210 μmol/L could give results visible to the naked eyes. The sensitivity of the PMA-HNB-LAMP method was 2.4 × 102 CFU/mL for pure bacterial culture. The detection limit for artificially contaminated meat was 2.3 × 104 CFU/mL. Using the national standard method， PMA-HNB-LAMP and HNB-LAMP， the detection rates of L. monocytogenes in 20 meat products available on the market were 5%， 10% and 20%， respectively. PMA-HNB-LAMP is superior to traditional LAMP in avoiding false-positive results to a certain extent， and it has the advantages of simple operation and strong visibility.
　　Keywords： Listeria monocytogenes; propidium monoazide; hydroxynaphthol blue; loop-mediated isothermal amplification; poultry and livestock meat
　　DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200113-009
　　中图分类号：TS251.7                                      文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2020）05-0048-05
　　单核细胞李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一种人畜共患病致病菌，该菌可引起脑膜炎、败血症、孕妇流产等[1-2]。单核细胞李斯特菌在-4～45 ℃的环境下均能生存，肉及肉制品是其主要污染源[3-4]。单核细胞李斯特菌的传统微生物检测方法需要经过培养、分离和生化鉴定，时间一般为5～7 d[5]，这并不能满足生产过程中品质控制检测时的限性要求，因此建立单核细胞李斯特菌的快速检测方法显得尤为重要。
　　单核细胞李斯特菌的快速检测方法主要包括基于DNA水平的实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）法[6-7]、环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）法[8-9]、重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification，RPA）法[10]和数字PCR法[11]等，以及处于蛋白质水平的基于免疫机制的方法[12-13]。LAMP技术由于不需要高温变性、退火等步骤，因此在恒温条件下就可实现目标DNA的高效扩增，与PCR、定量PCR等技术在快速检测场景中相比，具有简便、快捷且无需昂贵的热循环设备等优势，是目前广泛使用的恒温核酸扩增技术之一[14-15]。 　　传统的LAMP法仍存在一些不足。一方面，结果可视性不强。虽然LAMP反应后会产生焦磷酸镁沉淀，并在定性检测时可用肉眼直接观察结果，但当低拷贝的模板存在时焦磷酸镁沉淀产生较少，肉眼判断困难。目前通常将LAMP反应与凝胶电泳或浊度仪结合[16-17]，或者在反应体系中加入荧光染料通过仪器进行判读[18]，但这些改进措施都需要借助仪器。另一方面，LAMP等基于DNA扩增的检测方法难以区分样品中的“死菌”与“活菌”，因此易造成假阳性结果[19]。
　　羟基萘酚蓝（hydroxynaphthol blue，HNB）是一种金属离子指示剂[20]，在LAMP反应前添加HNB，反应后的阴性管会呈紫罗兰色，阳性管呈天蓝色，因此可用于增强LAMP检测结果的可视性。HNB-LAMP法检测单核细胞李斯特菌，结果判定快速、直观和简便[21-22]。
　　叠氮溴化丙锭（propidium monoazide，PMA）联合LAMP技术可选择性抑制死菌细胞DNA扩增[23-24]。Zhong Qingping等[25]运用PMA-LAMP技术检测金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），结果表明运用PMA-LAMP技术能在不受死细胞和其他细菌干扰的情况下检测金黄色葡萄球菌的活的但非可培养状态细胞。马骉等[26]建立PMA-LAMP法检测副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus），结果表明PMA-LAMP法可有效剔除死细胞和其他细菌干扰。Kragh等[27]用PMA-PCR法研究热处理和干燥处理后的单核细胞李斯特菌活菌，结果表明PMA对活细胞检测至关重要。本研究将PMA、HNB和LAMP技术结合，建立操作简单、设备要求低、结果判定直观的单核细胞李斯特菌活菌的可视化PMA-HNB-LAMP检测方法，并将其用于畜禽肉中单核细胞李斯特菌的检测，为食品企业在生产经营环节品质控制和病原菌现场检测中提供新的思路。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料与试剂
　　单核细胞李斯特菌ATCC 19115、单核细胞李斯特菌分离株（B60、B62）、英诺克李斯特菌（Listeria innocua）ATCC 33090、伊氏李斯特菌（Listeria ivanovii）ATCC 19119、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）ATCC 14028、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 6538、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）ATCC 12228、阪崎腸杆菌（Enterobacter sakazakii）ATCC 51329、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）FSCC 206546、大肠埃希氏菌（Escherichia coli）ATCC 25922、副溶血性弧菌FSCC 232009、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）FSCC 206003，所用标准菌株均购自美国典型菌种保藏中心，单核细胞李斯特菌分离株来自生鸡肉中检出的单核细胞李斯特菌阳性菌，-80 ℃保存于实验室。
　　单核细胞李斯特菌增菌肉汤（LB1）、胰酪胨大豆琼脂（含0.6%酵母浸膏）、PALCAM琼脂、单核细胞李斯特菌显色培养基、营养肉汤 北京陆桥技术有限责任公司;Bst DNA聚合酶 New England Biolab公司;甜菜碱 美国Sigma公司;dNTPs、LAMP引物 生工生物工程（上海）股份有限公司;HNB（分析纯） 上海麦克林生化科技有限公司;PMA 美国Biotium公司;细菌基因组DNA提取试剂盒 天根生化科技（北京）有限公司;单核细胞李斯特菌免核酸提取核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法） 卡尤迪生物科技（北京）有限公司;可视化单核细胞李斯特菌核酸快速检测试剂盒 广东环凯微生物科技有限公司。
　　1.2 仪器与设备
　　WNB-45恒温水浴箱 德国美墨尔特公司;A2生物安全柜 赛默飞世尔科技（中国）有限公司;CFX96 TOUCH-实时荧光定量PCR仪 美国Bio-Rad公司。
　　1.3 方法
　　1.3.1 DNA模板的制备
　　将-80 ℃保存的单核细胞李斯特菌活化后接种到LB1增菌液中，30 ℃培养24 h，以此为菌原液。吸取1 mL菌原液加入9 mL无菌生理盐水中制成1∶10菌液，充分混匀后吸取1 mL菌液到9 mL无菌生理盐水中制成1∶100菌液，重复上述步骤制成10 倍系列梯度稀释菌液，用细菌基因组DNA提取试剂盒提取各梯度稀释菌液制备DNA模板，同时采用平板计数法对各梯度稀释菌液进行菌落计数。
　　1.3.2 死菌的制备
　　采用高温煮沸法制备死菌用于PMA处理。将上述各梯度单核细胞李斯特菌稀释菌液于100 ℃加热10 min，作为死菌液。在30 ℃培养48 h以上进行平板计数，以确保无活菌生长。
　　1.3.3 PMA处理的优化
　　参考文献[28-29]进行PMA处理，将单核细胞李斯特菌死菌液菌体浓度调整为105 CFU/mL，分别加入质量浓度5、10、20、30、40、50 ?g/mL的PMA，室温避光孵育15 min后，LED蓝光仪曝光15 min。按照试剂盒说明书进行PCR扩增，确定能够抑制105 CFU/mL单核细胞李斯特菌死菌DNA扩增的PMA质量浓度范围。在该质量浓度范围内，对单核细胞李斯特菌活菌（菌体浓度103～105 CFU/mL）进行PMA处理，确定对死菌DNA扩增抑制效率最高但不能抑制活菌DNA扩增的PMA质量浓度。
　　1.3.4 LAMP反应体系的建立
　　采用SN/T 2754.4—2011《出口食品中致病菌环介导恒温扩增（LAMP）检测方法 第4部分：单核细胞增生李斯特菌》中的反应体系[30]。反应体系体积25 ?L，包括1.6 mmol/L dNTPs 4 ?L、8.0 mmol/L MgSO4溶液1 ?L、1.6 ?mol/L FIP引物1 ?L、1.6 ?mol/L BIP引物1 ?L、0.2 ?mol/L F3引物0.5 ?L、0.2 ?mol/L B3引物0.5 ?L、0.8 mol/L甜菜碱4 ?L、0.16 U/?L Bst DNA聚合酶0.5 ?L、1×ThermoPol 2.5 ?L、DNA模板2.5 ?L、去离子水7.5 ?L。引物序列如表1所示。 　　1.3.5 HNB浓度的优化
　　取1 mL菌体浓度107 CFU/mL菌液提取DNA，以超纯水作空白对照。在建立的反应体系中分别添加终浓度为240、210、180、150、120、90、60、30 ?mol/L的HNB，按照1.3.4节进行LAMP扩增反应，通过肉眼观察反应结果。阳性为天蓝色，阴性为紫罗兰色，以颜色差别明显、利于观察为标准确定最适宜HNB浓度。
　　1.3.6 HNB-LAMP法检测单核细胞李斯特菌的特异性与灵敏度分析
　　按照1.3.1节方法分别提取各受试菌株DNA，在上述优化的HNB-LAMP反应体系中进行扩增，验证其特异性。将制备的10 倍系列单核细胞李斯特菌稀释菌液的DNA模板按照前文建立的HNB-LAMP反应体系进行扩增，进行灵敏度分析。
　　1.3.7 肉制品中单核细胞李斯特菌的检出限分析
　　取25 g火腿肠（已检测未污染目标菌）加入225 mL无菌LB1中，均质2 min，制备样品匀浆。分别取1 mL 10 倍系列梯度稀释菌液加入9 mL样品匀浆中，混匀，平板计数法确定实际菌落数。提取样品匀浆中目标菌模板DNA，在优化的HNB-LAMP反应体系中进行扩增，确定检出限。
　　1.3.7 PMA-HNB-LAMP法检测人工污染单核细胞李斯特菌样品和实际冷冻畜禽肉样品
　　從市售熟肉制品中选取2 个样品（已检测未污染目标菌）制备样品匀浆，分别人工污染约105 CFU/mL单核细胞李斯特菌活菌和死菌。按照GB 4789.30—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验》、HNB-LAMP法和PMA-HNB-LAMP法分别进行检测。PMA-HNB-LAMP法和HNB-LAMP法直接取人工污染的样品匀浆，提取DNA进行后续检测。国家标准方法检测时需将人工污染样品匀浆，于30 ℃培养24 h后进行后续检测。随机选取市售冷冻畜肉和冷冻禽肉样品各10 份，按上述方法进行检测。
　　2 结果与分析
　　2.1 PMA处理法的优化结果
　　1～7. PMA质量浓度分别为0、5、10、20、30、40、50 ?g/mL。
　　由图1可知，质量浓度5～50 ?g/mL的PMA处理105 CFU/mL的单核细胞李斯特菌死菌后，实时PCR扩增结果表明，各质量浓度的PMA处理组均能完全抑制105 CFU/mL单核细胞李斯特菌死菌DNA扩增。
　　1～9. PMA质量浓度/（μg/mL）/活菌浓度/（CFU/mL）分别为0/103、0/104、0/105、5/103、5/104、5/105、10/103、10/104、10/105。
　　以质量浓度5、10 ?g/mL的PMA分别处理菌体浓度103、104、105 CFU/mL的单核细胞李斯特菌活菌菌液。由图2可知：5 ?g/mL PMA处理不能抑制单核细胞李斯特菌活菌的DNA扩增;10 ?g/mL PMA处理能够抑制菌体浓度为103 CFU/mL单核细胞李斯特菌活菌的DNA扩增，但菌体浓度（104、105 CFU/mL）较高时，不具有抑制作用。最终确定单核细胞李斯特菌的PMA处理最佳参数为室温避光孵育15 min、曝光15 min、PMA质量浓度5 ?g/mL。
　　2.2 可视化HNB-LAMP反应体系的优化结果
　　1. 单核细胞李斯特菌;2. 空白对照组。A～H. HNB浓度分别为30、60、90、120、150、180、210、240 ?mol/L。
　　由图3可知，HNB浓度为180～240 ?mol/L时，阴性反应管（空白对照组）与阳性反应管颜色对比明显。因此，选择HNB浓度210 ?mol/L。
　　2.3 可视化HNB-LAMP法的特异性与灵敏度结果
　　1～6. 稀释倍数分别为102、103、104、105、106、107;7. 阳性对照;8. 阴性对照。A. HNB-LAMP反应体系;B. 市售钙黄绿素-LAMP试剂盒。
　　各受试菌株DNA在优化的HNB-LAMP反应体系中扩增以验证方法特异性。仅单核细胞李斯特菌ATCC19115、单核细胞李斯特菌分离株B60和B62反应管为阳性，呈天蓝色，其余受试菌株反应管均呈紫罗兰色，表明该方法具有特异性。通过平板计数确定各梯度稀释菌液的菌体浓度为2.4×102～2.4×107 CFU/mL。由图4可知，各梯度稀释菌液反应管均呈天蓝色，表明可视化HNB-LAMP法的纯菌液检测灵敏度达到102 CFU/mL，与市售钙黄绿素-LAMP试剂盒的反应结果一致。
　　2.4 人工污染肉制品中可视化HNB-LAMP法的检出限分析结果
　　1～7. 菌体浓度分别为2.3×101、2.3×102、2.3×103、2.3×104、2.3×105、2.3×106、2.3×107 CFU/mL;8. 阳性对照;9. 阴性对照;10. 样品匀浆。
　　取1 mL菌体浓度为2.3×102～2.3×108 CFU/mL的单核细胞李斯特菌菌液加入9 mL火腿样品匀浆中，通过平板计数确定实际菌落数为2.3×101～2.3×107 CFU/mL。由图5可知，菌体浓度为2.3×104～2.3×107 CFU/mL时，反应管呈蓝色，表明所建立的反应体系对人工污染肉制品中单核细胞李斯特菌的检出限为104 CFU/mL。
　　2.5 人工污染单核细胞李斯特菌样品和实际冷冻畜禽肉样品检测结果
　　传统微生物方法、HNB-LAMP法和PMA-HNB-LAMP法检测人工污染活菌样品的结果均为阳性;PMA-HNB-LAMP法和传统微生物方法检测人工污染死菌样品的结果均为阴性，LAMP法检测结果为阳性，表明PMA-HNB-LAMP法能抑制单核细胞李斯特菌死菌的扩增。 　　对于随机选取的20 份冷冻畜禽肉样品，HNB-LAMP法检出阳性样品4 个（样品编号5、9、14、15），阳性率20%;PMA-HNB-LAMP法检出阳性样品2 个（样品编号5、14），阳性率10%;传统微生物方法检出阳性样品1 个（样品编号14），阳性率5%。PMA-HNB-LAMP法与传统微生物方法的检测结果相比，样品5检出假阳性，这可能是由于PMA处理对该样品中的死菌不具有抑制效果，也可能是存在非单核细胞李斯特菌的假阳性菌株。PMA-HNB-LAMP法与HNB-LAMP法的检测结果相比，少检出2 个阳性样品，由于这2 个样品的传统微生物方法检测结果也为阴性，说明该样品中单核细胞李斯特菌的死菌数低于105 CFU/mL，其扩增经过PMA处理后被抑制，也可能是HNB-LAMP法处理后出现了假阳性扩增现象。
　　3 结 论
　　GB 29921—2013《食品安全国家标准 食品中致病菌限量》中规定：预包装熟肉制品和即食生肉制品中每批次5 份样品中均不得检出单核细胞李斯特菌[31]。畜禽肉作为肉制品原料，是肉制品中单核细胞李斯特菌的主要污染来源之一。本研究将PMA、HNB和LAMP技术结合，建立用于检测单核细胞李斯特菌的PMA-HNB-LAMP法，该方法特异性强，纯菌液检测灵敏度可达2.4×102 CFU/mL，检测效果与市售试剂盒相当。对人工污染畜禽肉样品的检测结果与传统微生物方法一致;对实际畜禽肉样品检测时，该方法在一定程度上解决了由死菌扩增引起的假阳性问题，并且对设备要求简单，因此可用于肉制品企业生产中的品质控制。但是检测结果中仍出现了假阳性结果，因此仍需作进一步研究。
　　此方法解决了LAMP技术的2 个方法学问题，即添加指示剂实现可视化检测结果，以及区别检测食品中单核细胞李斯特菌的死菌和活菌从而降低假阳性率。该方法克服了检测设备简单、检测人员不足的困难，可推广应用于多种致病菌的检测，为食品安全提供新的检测思路和技术平台支持。
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