超高效液相色谱-串联质谱法同时检测鸡蛋中甲硝唑与地美硝唑及其代谢物残留

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　　摘要    建立了鸡蛋中甲硝唑、地美硝唑及其代谢物残留的UPLC-MS/MS检测方法。样品经乙酸乙酯提取、液液分配和MCX固相萃取柱净化富集后UPLC-MS/MS检测，以乙腈和水（0.1%甲酸）为流动相，经C18（2.1×50 mm，1.8 μm）色谱柱分离后，在正离子模式下采用多反应监测模式进行测定。结果表明，甲硝唑、甲硝唑代谢物产物羟基甲硝唑、地美硝唑、地美硝唑代谢产物羟甲基甲硝咪唑在1.0～100 ng/mL范围内线性关系良好，相关系数均大于0.997 5，在1.0、5.0、20.0 μg/kg 3个浓度水平下进行加标回收试验，平均回收率为68.1%～92.3%，RSD为3.4%～9.0%，方法检出限为0.1 μg/kg。该方法灵敏性、准确性、稳定性好，适用于鸡蛋中甲硝唑、地美硝唑及其代谢物残留的定性和定量分析，为鸡蛋中硝基咪唑类药物检测提供一定的技术参考。
　　关键词    甲硝唑;地美硝唑;代谢物;鸡蛋;超高效液相色谱-串联质谱
　　中图分类号    O657.63;TS251.55        文献标识码    A
　　文章编号   1007-5739（2020）22-0191-03                                                开放科学（资源服务）标识码（OSID）
　　甲硝唑、地美硝唑是人工合成硝基咪唑类药物，对肠道和组织的厌氧菌感染、家禽的滴虫病感染、鸡生殖系统疾病等疗效好[1]，因而常被添加于饲料中，用于改善饲料转化率[2]。硝基杂环类化合物是引起细胞诱变的物质，硝基咪唑类药物及其代谢产物具有潜在的动物致癌、致畸、诱变和遗传毒性作用[3]，其残留对动物性食品构成了威胁。《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》（GB 31650—2019）中规定甲硝唑、地美硝唑允许作治疗用兽药，但不得在动物性食品中检出[4]。日本规定甲硝唑、地美硝唑在食品中不得检出，欧盟和美国均规定了甲硝唑、地美硝唑为禁用兽药[5-6]。
　　我国已制定了一些针对硝基咪唑类药物的检测标准，但鲜见鸡蛋中硝基咪唑类药物的检测。现有的国家标准与文献研究的基质多集中在畜禽类组织、饲料、蜂蜜等方面，对鸡蛋中硝基咪唑类药物多组分残留及代谢物研究甚少。本试验针对鸡蛋的基质特点，对样品提取、净化条件进行优化，利用液相色谱-串联质谱技术建立了鸡蛋中甲硝唑（Metronidazole MNZ）、地美硝唑（Dimetridazole DMZ）、甲硝唑代谢产物羟基甲硝唑（Metronidazole-OH MNZOH）、地美硝唑代谢产物羟甲基甲硝咪唑（2-Hydroxymethyl-1-methyl-5-nitro-1H-imidazole HMMNI）残留同时检测的方法。该方法灵敏度高，重现性好，适合大批量样品检测。
　　1    材料与方法
　　1.1    仪器与设备
　　1290-6460高效液相色谱-四级杆串联质谱联用仪，美国Agilent公司;Milli-Q超纯水仪，美国密理博公司;旋转蒸发仪，德国IKA公司;高速离心机，湖南湘仪公司;氮吹仪。
　　1.2    材料与试剂
　　甲硝唑、地美硝唑、羟基甲硝唑、羟甲基甲硝咪唑标准品，浓度均为100 μg/mL，天津阿尔塔科技有限公司;乙腈、甲醇、甲酸，均为色谱纯，Fisher公司;其他试剂均为分析纯试剂;试验用水为超纯水;Oasis MCX固相萃取柱（60 mg/3 mL），美国Waters公司。
　　1.3    试验方法
　　1.3.1    溶液配制。标准溶液的配制：吸取100 μg/mL标准溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中，甲醇稀释至刻度，配制成质量浓度为10 μg/mL的标准溶液，-20 ℃下保存。标准中间使用液的配制：吸取10 μg/mL标准溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，配制成质量浓度为1 μg/mL的标准溶液，-20 ℃下保存。基质标准工作液：吸取一定量的标准中间使用液，用空白样品提取液配制成基质混合标准工作液。
　　1.3.2    样品制备。鸡蛋去壳，放入容器，用匀浆机将样品搅拌混匀，装入洁净样品盒中，-20 ℃以下保存，试验前解冻混匀称样。
　　1.3.3    提取。称取2.0 g（精确至0.01 g）样品于50 mL塑料离心管中，加入15 mL乙酸乙酯2 500 r/min涡动5 min，6 000 r/min离心5 min，上清液转移至鸡心瓶中，残渣再用10 mL乙酸乙酯提取1次，合并2次提取液，35 ℃水浴下旋转浓缩至干后加入0.1 mol/L盐酸溶液，充分溶解残渣，再加入5 mL正己烷，充分混匀，转移至15mL塑料离心管中，6 000 r/min离心5 min，去除上层正己烷层，下层备用。
　　1.3.4    净化。MCX固相萃取柱使用3 mL甲醇、3 mL 0.1 mol/L盐酸溶液活化平衡后，加入备用液，然后依次用3 mL 0.1 mol/L盐酸溶液、3 mL甲醇、3 mL 2%氨水-甲醇（9∶1，体积比）淋洗并挤干，5%氨水-甲醇（2∶3，体积比）3 mL洗脱，洗脱液于35 ℃氮气吹至1 mL以下，0.1 mol/L甲酸溶液-乙腈（9∶1，体积比）定容至1.0 mL，混匀后过0.22 μm有机微孔滤膜，供LC-MS/MS检测。 　　1.3.5    仪器条件。色谱条件：色谱柱ZORBAX Eclipse Plus C18（Rapid Resolution HD 2.1×50 mm，1.8 μm）;流速0.3 mL/min;柱温35 ℃;进样量2 μL;流动相A为水（0.1%甲酸），流动相B为乙腈;梯度洗脱程序见表1。
　　质谱条件：离子源AJS-ESI;毛细管电压4 000 V;雾化气压力0.31 MPa;干燥气温度300 ℃;干燥气流量5 L/min;鞘气流量11 L/min;鞘气温度250 ℃;喷嘴电压0 V;离子极性正;质量扫描模式MRM。
　　2    结果与分析
　　2.1    质谱条件优化
　　选择ESI（+）的电离模式下对目标物进行一级质谱分析，确定各目标物的分子离子峰，均为[M+H]+型。以分子离子峰作为母离子作二级质谱扫描，并进行质谱条件优化，选取离子丰度较高、干扰小的2个碎片离子作为目标物的定性和定量离子。甲硝唑、地美硝唑及其代谢物的母离子、定性和定量离子及碰撞能见表2。标准溶液提取离子流图见图1。
　　2.2    提取方法的选择
　　甲硝唑在水中微溶，而地美硝唑不溶于水但能溶于稀酸，在乙腈和乙酸乙酯中溶解性均较好。试验选取乙酸乙酯和乙腈为提取溶剂并进行比较。结果表明，乙腈沉淀蛋白作用良好，能形成致密的蛋白质沉淀，但提取杂质多，提取液旋蒸浓缩时间长，0.1 moL/L盐酸溶液溶解残渣时杂质易析出，且极易堵塞净化柱。从5 μg/kg的添加回收效果来看，乙腈作为提取溶剂时对甲硝唑和地美硝唑的回收率低于70%，对羟基甲硝唑和羟甲基甲硝咪唑的回收率不足50%。而乙酸乙酯作提取溶剂时，提取杂质较少，旋蒸浓缩过程平稳、时间短，并有利于正己烷脱脂，对各目标物回收效果均理想。因此，选提取效率高的乙酸乙酯作提取溶剂。
　　2.3    固相萃取小柱的選择
　　试验考察了Oasis HLB、Oasis MCX、Agela Cleanert SCX、Agela Cleanert PCX 4种萃取小柱对各目标物的回收率（添加量为5 μg/kg）差异。结果表明，MCX、PCX、SCX萃取柱对甲硝唑、地美硝唑、羟甲基甲硝咪唑回收良好，回收率无显著差异，但MCX萃取柱对羟基甲硝唑的回收率优于PCX、SCX萃取柱，而HLB萃取柱对4种化合物回收率均偏低。因此，选用MCX萃取小柱为净化柱（图2）。
　　2.4    线性范围、线性方程与检出限
　　以空白基质液配制标准曲线，采用标准添加法评价方法的检出限。标准曲线的系列质量浓度为1.0、2.0、5.0、10.0、50.0、100 ng/mL，以目标化合物定量离子峰面积（Y）为纵坐标，以质量浓度（X）为横坐标，绘制标准曲线（表3），相关系数均大于0.997 5。当空白样品标准添加水平为0.1 μg/kg时，各化合物的信噪比（S/N）均大于3，故将各药物方法检出限定为0.1 μg/kg。
　　2.5    准确度和精密度
　　利用阴性鸡蛋样品通过标准添加试验考察方法的回收率以及精密度。分别在1.0、5.0、20.0 μg/kg 3个水平添加各成分，按照试验方法测定回收率，每个水平做6个平行性试验，计算平行回收率与相对标准偏差，结果见表4。结果显示，羟基甲硝唑的平均回收率为68.1%～72.0%，甲硝唑、地美硝唑、羟甲基甲硝咪唑的平均回收率为79.1%～92.3%，相对标准偏差为3.4%～9.0%，方法准确度和精密度满足药物残留检测的要求。
　　3    结论
　　本文采用超高效液相色谱串联质谱技术建立鸡蛋中甲硝唑、地美硝唑及其代谢物残留同时检测的分析方法。样品经乙酸乙酯提取、MCX固相萃取柱净化富集后UPLC-MS/MS检测，该法操作方便、对鸡蛋基质净化效果好、灵敏度高、专属性强、精密度良好，可实现鸡蛋样品中硝基咪唑类药物的分析确证。
　　4    参考文献
　　[1] 王艳丰，张丁华.蛋鸡健康养殖与疾病防治宝典[M].北京：化学工业出版社，2016.
　　[2] 郭礼强，张金玲，李凯，等.HPLC-MS/MS法测定饲料中甲硝唑和二甲硝咪唑含量[J].中国兽药杂志2017，51（1）：52-56.
　　[3] 丁燕玲，陈彤，黄婷.超高效液相色谱-串联质谱法测定鸡肉中甲硝唑、二甲硝唑及其代谢物的方法研究[J].广东化工，2018，45（375）：245-248.
　　[4] 中华人民共和国农业农村部，国家卫生健康委员会.食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量：GB 31650—2019[S].北京：中国标准出版社，2019.
　　[5] 李锐，钱鸣蓉，肖英平，等.国内外水禽产品中兽药残留限量标准比对分析[J].农产品质量与安全，2017（6）：28-31.
　　[6] 宋伟，胡艳云，韩芳，等.超高效液相色谱-串联质谱法同时测定鸡肉中的二氯二甲吡啶酚、磺胺类和喹诺酮类药物残留[J].色谱，2013，31（12）：1161-1166.
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