超高效液相色谱-串联质谱法测定马铃薯中唑菌酮、氰霜唑及其代谢物CCIM的残留量
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摘要：采用超高效液相色谱-串联质谱法同时测定马铃薯中唑菌酮、氰霜唑及其代谢物CCIM的含量，样品经含0.1%乙酸的乙腈溶液振荡提取，离心过滤后上机检测。结果显示，唑菌酮在0.002 0 mg/L～0.100 0 mg/L的浓度之间线性关系良好，r2≥0.998 6;氰霜唑及其代谢物CCIM在0.000 2 mg/L～0.010 0 mg/L的浓度之间线性关系良好，r2≥0.996 8。上述农药在马铃薯中的平均回收率在76.4%～95.9%之间，相对标准偏差（RSD）在0.91%～5.62%之间，定量限在0.01～0.02 mg/kg之间。该方法简单、快速、准确性好、灵敏度高，能够满足马铃薯中唑菌酮、氰霜唑及其代谢物CCIM残留量的检测要求。
关键词：唑菌酮;氰霜唑;CCIM;马铃薯;超高效液相色谱-串联质谱法
中图分类号： S482.2;S481+.8 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2020）17-0206-04
唑菌酮是一种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，对防治各种霜霉病、黑斑病、晚疫病效果显著[1-3]。氰霜唑是一种新型环境保护型的苯并磺胺咪唑类杀菌剂，对疫霉菌、腐霉菌等卵菌纲病原菌具有很高的活性[4-5]。由于氰霜唑在与其他杀菌剂共同施用时，具有无交叉抗性的特点，可以与唑菌酮制成混剂，这种混剂对于治疗马铃薯晚疫病和霜霉病效果显著[6]。在2014—2018年间，唑菌酮和氰霜唑分别作为有效成分以不同剂型在我国马铃薯病虫草害防治上登记的数量分别为7、23个[7]。然而，氰霜唑在使用后会迅速分解成4-氯-5-（4-甲苯基）-1H-咪唑-2-腈（CCIM）、4-氯-5-（4- 甲苯基）-1H-咪唑-2-羧酸（CCTA）、4-氯-5（4-甲苯基）-1H-咪唑-2-甲酰胺（CCIM-AM）等多个代谢产物。其中CCIM作为主要降解产物，比氰霜唑具有更高的毒性[5]。
目前，国内外尚未有文献报道能同时检测马铃薯中唑菌酮、氰霜唑、CCIM残留量的分析方法。本研究采用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）法建立同时测定马铃薯中唑菌酮、氰霜唑及其代谢物CCIM含量的分析方法。在样品前处理过程中，经过反复试验、对比回收率，确立马铃薯样品用含0.1%乙酸的乙腈振荡提取，离心过滤后直接经UPLC-MS/MS检测的方法，较传统QuEChERS方法更加简捷、经济、高效。本研究方法在覆盖2个数量级的线性范围内[8]，线性关系良好，并得到较高的准确度和精密度。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
主要的试验仪器有PerkinElmer Qsight超高效液相色谱仪-串联三重四级杆质谱仪（珀金埃尔默仪器有限公司）、梅特勒-托利多PB-10pH计、梅特勒-托利多XS205DU型分析天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]、美的WBL25B36榨汁机（美的公司）、Sigma 3K15高速冷冻离心机（日本Sigma公司）、ZWY-211C恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）。
主要的试验试剂有哇哈哈纯净水，甲醇、乙腈（色谱级，美国Fisher公司），甲酸（色谱级，Acros Organics公司），乙酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），农药标准品：氰霜唑、CCIM、唑菌酮[国家农药质量监督检验中心（沈阳）]，N-丙基乙二胺（PSA）固相吸附剂40～60 μm、C18净化剂（Agela Technologies）。
1.2 试验方法
1.2.1 标准溶液的配制 将标准溶液经乙腈逐级稀释，配制成100、10、1 mg/L的标准溶液储备液，将浓度为1 mg/L的储备液分别用乙腈（含0.1%乙酸）和空白基质稀释，唑菌酮配制成0.002 0、0.005 0、0.010 0、0.020 0、0.050 0、0.100 0 mg/L系列浓度的工作溶液;氰霜唑和CCIM配制成 0.000 2、0.000 5、0.001 0、0.002 0、0.005 0、0.010 0、0.020 0 mg/L系列浓度的混合工作溶液。
1.2.2 样品前处理 采用改进后的QuEChERS方法：称取（10±0.05） g经榨汁机搅碎后的马铃薯样品置于三角瓶中，加入50 mL乙腈（含1%乙酸），180 r/min 振荡30 min后，加入6 g氯化钠振荡 2 min，盐析，以5 000 r/min的转速离心5 min，取2.0 mL上层清液直接过3次0.22 μm的有机系滤膜，UPLC-MS/MS检测。
1.2.3 仪器条件 色谱条件：色谱柱Phenomenex Kinetex 2.6 μm，C18（100 mm×4.6 mm），柱温为 40 ℃，流速为0.6 mL/min，进样量为10 μL，流动相为A相：水（含0.1%甲酸），B相：乙腈。洗脱条件见表1。
质谱条件：采用ESI电喷雾离子源，正离子模式，三重四级杆质量检测器。离子化电压为 5 800 V，离子源温度为400 ℃，反吹干燥器流速为100 μL/min，雾化气流速为180 μL/min，质谱接口加热温度HSID为300 ℃，真空室入口电压为10 V，利用质谱自带的多反应监测模式（multiple reaction monitoring，简称MRM）优化功能，获得不同离子对的碰撞室入口电压和碰撞能2个参数。3种农药的定性/定量离子对如表2。
1.2.4 测定方法 按“1.2.3”节的仪器条件，待儀器基线稳定后，连续注入数针标样溶液，直至相邻2针峰面积相对变化小于1.5%后，采用标准曲线、测试样品、标准曲线的顺序进行测定。同时，作溶剂空白和基质空白对照，按照标准曲线的线性方程对测试样品进行外标定量，色谱结果如图1所示。
2 结果与分析 2.1 馬铃薯样品前处理方法的选择
2.1.1 提取溶剂的选择 分别选取乙腈、甲醇、乙腈+0.1%乙酸、甲醇+0.1%乙酸等4种溶剂进行提取，发现采用甲醇、甲醇+0.1%乙酸2种溶剂时，振荡、盐析后，分层不明显，上层提取液混浊。采用乙腈作为提取溶剂时，氰霜唑、CCIM、唑菌酮的平均回收率分别为84.9%、87.2%、70.5%;用乙腈+0.1%乙酸作为提取溶剂，氰霜唑、CCIM、唑菌酮的平均回收率分别为88.4%、90.0%、76.2%，因此本研究选用乙腈+0.1%乙酸作为提取溶剂。
2.1.2 净化剂的选择 QuEChERS方法常用的净化剂包括GCB、MgSO4、PSA、C18等吸附填料[9-11]，通常PSA用于去除极性的有机酸、一些糖类、脂类;MgSO4用于去除水分;GCB用于去除色素、如叶绿素，但对平面结构药物会有吸附;C18用于去除脂类和固醇、类胡萝卜素等。本研究分别考察PSA和C18组合添加、单独添加、不添加对回收率的影响，结果发现，PSA和C18均对唑菌酮的回收率影响较大，回收率降低，怀疑与化合物分子结构有关[12-15]。而当不添加任何净化剂时，氰霜唑、CCIM、唑菌酮均能得到较好的回收率，且目标物并未受到基质中杂质的干扰，具体参见图2至图4。因此，本研究采用盐析分层后，不经净化，采用直接过滤的方式进行UPLC-MS/MS检测，此法更加经济、快捷、高效。
2.2 方法的线性相关性、基质效应评价
分别以唑菌酮、氰霜唑、CCIM标液的质量浓度（mg/L）对响应值（峰面积）进行线性回归，采用1/x2加权， 得出线性回归方程。基质效应评价按照纯溶剂标准溶液、基质标准溶液的顺序进行检测拟合标准曲线方程。其中，唑菌酮在纯溶剂中的曲线方程为y=553.760 00x-191.996 17，r2=0.998 7（n=6）;在马铃薯基质中的曲线方程为y=467.000 00x-260.444 61，r2=0.998 6（n=6）;基质效应 ME%=（553.76-467.00）/553.76×100%=15.67%;氰霜唑在纯溶剂中的曲线方程为y=9 930x-217，r2=0.999 2（n=7）;在马铃薯基质中的曲线方程为y=8 715x-118，r2=0.996 8（n=7），基质效应ME%=（9 930-8 715）/8 715×100%=13.94%;代谢物CCIM在纯溶剂中的曲线方程为y=34 302x-15，r2=0.996 4; 在马铃薯基质中的曲线方程为y=30 036x-216，r2=0.998 6;CCIM基质效应ME%=（34 302-30 036）/30 036×100%=14.20%。上述结果表明，3种农药在线性范围内，响应值与其质量浓度之间线性关系良好，且未见明显的基质效应。本研究采用基质配制工作溶液。
2.3 添加回收率及重复性
本试验设置3个添加水平，每个添加水平作3组平行试验，相应的回收率及相对标准偏差（relative standard deviation，简称RSD）结果如表3所示。由表3可知，3种农药平均回收率在76.4%～95.9%之间，相对标准偏差在0.91%～5.62%之间。
2.4 方法的定量限
以最小添加浓度作为方法的定量限、唑菌酮在马铃薯中的LOQ为0.02 mg/kg;氰霜唑、CCIM在马铃薯中的LOQ为0.01 mg/kg。本试验所测溶剂空白、马铃薯空白样品在目标物出峰区间的信号均小于LOQ水平响应的30%。
3 结论
本研究开发的方法，线性相关性、准确度、精密度、专属性LOQ的检测结果均达到指标。该方法简捷、高效，具有较高的灵敏度和良好的精密度等特点，能满足国内外相关农药最大残留量的标准要求，适合推广。
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