针刺对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠脊髓钙离子接头蛋白-1、环氧合酶-2及血清肿瘤坏死因子-α水平的影响

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　　 摘要：目的  观察针刺对实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠脊髓钙离子接头蛋白-1（IBA-1）、环氧合酶-2（COX-2）及血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平的影响，探讨其可能的作用机制。方法  将36只C57BL/6小鼠随机分为4组，正常组小鼠不予处理，其余小鼠均制作EAE模型。造模后第14日开始，正常组和模型组小鼠每日抓取1次，激素组小鼠给予醋酸泼尼松灌胃，针刺组小鼠针刺双侧“肾俞”“足三里”“大椎”。造模后28 d取材，检测小鼠血清TNF-α含量及脊髓COX-2、IBA-1阳性表达。结果  与正常组比较，模型组小鼠神经功能评分及TNF-α、COX-2、IBA-1水平均明显升高（P<0.01）;与模型组比较，针刺组和激素组小鼠神经功能评分和TNF-α、COX-2、IBA-1水平均明显降低（P<0.01）;与针刺组比较，激素组小鼠神经功能评分和COX-2、IBA-1水平均明显降低（P<0.05，P<0.01）。结论  针刺可降低EAE小鼠炎症反应，减轻脊髓神经损伤，其机制可能与降低血清TNF-α含量，减少脊髓COX-2、IBA-1阳性表达有关。
　　关键词：多发性硬化;针刺;钙离子接头蛋白-1;环氧合酶-2;肿瘤坏死因子-α;实验性自身免疫性脑脊髓炎;小鼠
　　中图分类号：R245    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2019）05-0049-05
　　DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.05.011 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　Abstract： Objective To observe the effects of acupuncture on the levels of IBA-1， COX-2 in spinal cord and serum TNF-α of experimental autoimmune encephalomyelitis （EAE） mice model; To clarify the mechanism of acupuncture treatment. Methods Thirty-six C57BL/6 mice were randomly divided into 4 groups. The normal group of mice were not immunologically molded， and the others were injected to replicate the EAE model. Since the 14th day after modeling， the normal group and the model group mice were taken once a day. Hormone group received prednisone acetate for gavage. Acupuncture group received acupuncture at “Shenshu”， “Zusanli”， and “Dazhui”. At the 28th day after of modeling， the content of serum TNF-α and the positive expressions of COX-2 and IBA-1 in the spinal cord were detected. Results Compared with the normal group， neurological function score， TNF-α， COX-2 and IBA-1 in the model group increased （P<0.01）. Compared with the model group， the neurological function scores and TNF-α， COX-2 and IBA-1 levels in the acupuncture group and the hormone group were significantly lower （P<0.01）. Compared with the acupuncture group， the neurological function score and COX-2 and IBA-1 levels in the hormone group were significantly lower （P<0.05， P<0.01）. Conclusion Acupuncture can reduce the inflammatory response of EAE mice and alleviate spinal nerve injury. The mechanism may be related to lowering serum TNF-α content and reducing the positive expressions of COX-2 and IBA-1 in spinal cord.
　　Keywords： multiple sclerosis; acupuncture; IBA-1; COX-2; TNF-α; experimental autoimmune encephalomyelitis; mice
　　多发性硬化以中枢神经系统炎性脱髓鞘病变为主要病理变化[1]。实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）为国际公认的多发性硬化动物模型。EAE动物模型病变部位存在炎症因子浸润、神经脱髓鞘病变甚至神经细胞空泡样坏死现象[2]。前期临床和实验研究表明，针刺可明显改善多发性硬化患者臨床疗效，降低EAE模型炎症因子水平，抑制炎症反应[3-5]。现代研究表明，环氧合酶（COX-2）参与炎症反应并与神经损伤关系密切，钙离子接头蛋白-1（IBA-1）由神经系统小胶质细胞分泌，也参与炎症反应。核因子-κB（NF-κB）信号通路在神经损伤时被激活，生成肿瘤坏死因子-α（TNF-α）参与炎症反应[6-8]。本实验观察针刺对EAE小鼠脊髓内IBA-1、COX-2和血清TNF-α水平的影响，进一步探究针刺治疗EAE的作用机制。 　　1  实验材料
　　1.1  动物
　　8～10周龄健康雌性C57BL/6小鼠36只，体质量18～20 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号SCXK（京）2012-0001。饲养于北京中医药大学SPF级动物房，温度20～24 ℃，相对湿度40%～60%，明暗周期12 h，自由摄食饮水。
　　1.2  主要试剂与仪器
　　MOG35-55肽段，北京百诺威生物有限公司，批号NJP30376;完全弗氏佐剂（其中结核杆菌H37Ra终浓度为4 mg/mL），北京华菁科技有限公司，批号170597;百日咳毒素，北京百诺威生物有限公司，批号181236A1;氯化钠注射液，华润双鹤药业股份有限公司，批号201804025;醋酸泼尼松片，上海上药信谊药厂有限公司，批号017171002;TNF-α ELISA检测试剂盒，联科生物技术有限公司，货号EK2821/2;兔抗COX-2多克隆抗体，英国Abcam公司，货号ab15191;兔抗AIF1/Iba1多克隆抗体，英国Abcam公司，货号ab178847。一次性0.25 mm×0.25 mm无菌针灸针，中研太和，批号172731;离心机，德国 Sartorius公司，型号Sigam1-14;光学显微镜，北京锐驰恒业仪器有限公司，型号CX23;石蜡切片机，沈阳裕德电子仪器公司，型号SYD-S3050;酶标仪，美国BioTeK公司，型号FLX800T。
　　2  实验方法
　　2.1  造模
　　将MOG35-55多肽用生理盐水稀释至10 mg/mL，再与完全弗氏佐剂按1∶1比例充分混合至油包水乳剂，制成完全抗原。小鼠乙醚麻醉并固定，进行免疫造模。将配制好的完全抗原按0.1 mL/只在小鼠背部脊柱旁分4点皮下注射。于免疫后第0、2日腹腔内注射500 ng/只百日咳毒素，建立小鼠EAE模型[9-11]。
　　2.2  模型评价
　　从第0日开始，直到第28日实验取材为止，每日9：00-11：00依据Kono等[12]神经功能评分标准。0分为无明显异常;1分为动物尾部张力降低或无力，动作笨拙，轻度步态不稳定;2分为尾部无张力且后肢无力，可伴有中度步态异常或姿态维持缺乏;3分为后肢力弱或瘫痪，可伴有轻度前肢无力及轻度麻痹;4分为肢体严重麻痹，甚至全身瘫痪，被动翻身后不能复原;5分为濒死状态。症状在二者之间按0.5分计算。将评分1～4分的小鼠纳入实验。
　　2.3  分组及干预
　　C57BL/6小鼠适应性喂养1周，采用随机数字表法分为正常组、模型组、激素组和针刺组，每组9只，均常规饲养。正常组小鼠不做处理，其余小鼠均行EAE造模，造模当日记为第0日。小鼠造模后第14日起每日14：00-16：00进行干预。正常组和模型组小鼠每日抓取、固定1次，给予生理盐水0.1 mL/10 g灌胃，连续15 d;激素组进行激素冲击疗法，将醋酸泼尼松片溶于生理盐水，浓度为0.6 mg/mL，将小鼠固定后每日给予醋酸泼尼松药液0.1 mL/10 g灌胃，连续15 d;针刺组针刺“大椎”（第7颈椎与第1胸椎之间，背部正中，直刺2～3 mm）、双侧“肾俞”（第2腰椎下兩旁，向脊柱方向斜刺2～3 mm）、双侧“足三里”（膝关节外侧，腓骨小头下0.3 cm处，直刺2～3 mm），每日针刺1次，留针15 min，共15次。第28日，小鼠眼球采血0.8～1 mL，取脊髓置于-80 ℃冰箱保存待检。
　　2.4  指标检测
　　每日进行小鼠神经功能评分;用ELISA试剂盒检测小鼠血清TNF-α含量;用兔抗COX-2多克隆抗体、兔抗AIF1/Iba1多克隆抗体和免疫组化检测小鼠脊髓COX-2、IBA-1阳性表达平均光密度（MOD）。
　　3  统计学方法
　　采用SPSS20.0统计软件进行分析。实验数据以±s表示，进行正态性检验和方差齐性检验，组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
　　4  结果
　　4.1  针刺对模型小鼠神经功能评分的影响
　　第0日，小鼠神经功能评分均为0分;第12日模型组小鼠开始出现轻度动作笨拙、步态不稳症状，神经功能评分为（0.11±0.22）分，其余组别未有变化;模型组第20日时评分达到峰值（3.11±0.42）分，之后评分逐渐减少;针刺组小鼠第16日出现尾部张力降低或无力，动作笨拙等神经功能异常症状，神经功能评分为（0.89±0.33）分，第24日神经功能评分最高（2.06±0.30）分，之后评分有所下降;激素组小鼠第16日出现尾部张力降低或无力，轻度步态不稳，神经功能评分为（0.44±0.30）分，第24日评分达到峰值（1.67±0.35）分。结果见表1。
　　4.2  针刺对模型小鼠脊髓环氧合酶-2、钙离子接头蛋白-1表达的影响
　　与正常组比较，模型组小鼠脊髓COX-2、IBA-1阳性表达明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较，针刺组和激素组小鼠脊髓COX-2、IBA-1阳性表达明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）;与针刺组比较，激素组小鼠脊髓COX-2、IBA-1阳性表达明显降低，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。结果见表2。
　　4.3  针刺对模型小鼠血清肿瘤坏死因子-α含量的影响
　　与正常组比较，模型组小鼠血清TNF-α含量明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较，针刺组和激素组小鼠血清TNF-α含量明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）;与针刺组比较，激素组小鼠血清TNF-α含量无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）。结果见表3。 　　4.4  免疫组化染色结果
　　COX-2、IBA-1主要存在于EAE模型小鼠脊髓胞浆内，表现为黄色或棕黄色颗粒。正常组小鼠脊髓细胞形态规则，染色均匀，细胞染色多为蓝色，胞浆内可见少量COX-2、IBA-1黄色颗粒。与正常组比较，模型组小鼠脊髓胞浆内黄色颗粒明显增多，细胞体积增大，形态呈不规则状，COX-2、IBA-1含量明显增加;与模型组比较，针刺组和激素组小鼠脊髓胞浆内黄色颗粒有所减少，细胞形态较规则，COX-2、IBA-1含量降低;与针刺组比较，激素组小鼠脊髓胞浆内黄色颗粒较少，染色较浅，正常细胞数量较多，细胞形态较规整。结果见图1、图2。
　　5  讨论
　　多发性硬化发作时，参与的主要免疫细胞有T细胞和巨噬细胞。中枢神经脱髓鞘病变，刺激小胶质细胞发生免疫反应，生成大量炎症因子，随着病情进展，外周T细胞、巨噬细胞、炎症因子等通过血脑屏障，在中枢神经系统发生免疫反应，产生大量促炎因子，炎症级联反应导致过度炎症反应，损伤神经髓鞘，影响神经功能[13-14]。此外，小胶质细胞还可呈递抗原给T细胞、巨噬细胞，加重炎症反应、神经损伤[15]。EAE动物造模机制与多发性硬化相似，与炎症反应关系密切，动物血脑屏障被破坏，产生炎症因子进入中枢神经，诱导发生过度炎症反应，造成神经炎性、脱髓鞘病变[16]。
　　COX-2是花生四烯酸转化为前列腺素的限速酶，通常COX-2分泌很少或不分泌，炎症反应时明显增多。EAE小鼠COX-2 mRNA表达水平明显升高，COX-2通过PI3K-Akt、JNK1/2等炎症相关信号通路促进炎症反应，并诱导产生其他炎症因子，通过血脑屏障，激活小胶质细胞，促进炎症反应，攻击神经髓鞘，加重中枢神经损伤[17-20]。敲低lincRNA-Cox2可促进小胶质细胞自噬、抑制巨噬细胞激活，使小胶质细胞处于静息状态，减轻炎症损伤，减少EAE发病，改善EAE临床症状[21]。小胶质细胞受炎症刺激活化变形时会产生IBA-1、TNF-α，二者均可促进炎症因子释放，形成炎症级联反应，加重炎症反应[22-23]。此外，巨噬细胞在神经系统受到炎症刺激时活化，也會产生IBA-1，促进炎症反应[24]。
　　多发性硬化属中医学“风痱”“痿证”“痹证”范畴，多有外感史，邪毒外袭，素体亏虚，无力抗邪而发病，或内生邪毒阻滞脉络，痰瘀内生，蕴集于髓脑，清阳不升，浊阴不降，筋脉失养，久而成疾[25]。病位在脑、脊髓，与肾、脾、胃相关，证属肾精亏虚，后天不足，髓脑失养。肾为后天之本，肾生髓，肾精亏虚，化髓无源，髓海空虚，脑失髓养而发。肾精不足，损及肾阳，肾阳亏虚，鼓动无力，精髓无力上呈，髓脑失养加重。本研究选穴为肾俞（双侧）、大椎。肾俞属足太阳膀胱经，为肾脏背腧穴。“膀胱足太阳之脉，起于目内毗，上额，交巅……其直者，从巅入络脑”（《灵枢·经脉》）。针刺双侧肾俞可补肾益髓，助阳化髓，补益髓脑，亦可疏通膀胱经脉，促进髓、脑精微物质循环。足三里属足阳明胃经，是胃经的合穴。临床素有“治痿独取阳明”，阳明经多气多血，针刺足三里可补益气血，濡养经筋。脾胃位于中焦，针刺足三里可补益中焦、固护后天、濡养先天。大椎属督脉，是督脉与手足三阳经的交会穴，为“诸阳之会”。督脉为“阳经之海”，主一身之阳气，行于背部正中，上至风府，入属于脑，脑、脊髓精液通过督脉相沟通，针刺大椎，可振一身之阳气，助肾髓上行于脑[26]。此外，针刺大椎，升发阳气，还可抵抗邪毒，驱邪外出。针刺肾俞（双侧）、大椎可补肾益髓、升阳化髓，驱邪外出，治疗多发性硬化具有良好的效果。
　　本实验结果表明，模型组较正常组小鼠神经功能评分、血清TNF-α含量及脊髓COX-2、IBA-1表达均明显升高;针刺与激素治疗后明显降低EAE小鼠神经功能评分，延迟EAE发作，且EAE小鼠血清TNF-α含量、脊髓COX-2、IBA-1表达均明显降低;激素组较针刺组在改善小鼠神经功能评分及脊髓组织COX-2、IBA-1阳性表达方面效果更明显。
　　综上，对EAE小鼠采用激素冲击或针刺治疗，均可降低EAE模型小鼠COX-2、IBA-1、TNF-α水平，降低EAE神经功能评分，说明激素冲击、针刺治疗均可延迟、减轻EAE小鼠神经损伤。虽然与针刺治疗相比，激素冲击疗法降低EAE小鼠神经功能评分及降低脊髓COX-2、IBA-1表达效果更佳，但激素冲击治疗不良反应大。所以，针刺EAE小鼠“肾俞”“足三里”“大椎”可安全有效地抑制中枢神经炎症反应，延迟、减轻神经功能损伤，抑制小胶质细胞活化，降低炎症反应，保护脊髓神经，治疗多发性硬化。今后将进一步深入研究，明确针刺治疗EAE小鼠作用靶点、信号传导通路及其对基因表达的影响。
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　　（收稿日期：2018-09-19）
　　（修回日期：2018-10-08;编辑：华强）
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