鹿角壮骨胶囊对膝骨关节炎兔血清及软骨IL-6、MMP-3的影响

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　　摘要：目的  探討鹿角壮骨胶囊对膝骨关节炎兔血清及软骨IL-6、MMP-3的影响。方法  采用木瓜蛋白酶右侧膝关节腔内注射诱导建立兔膝骨关节炎模型，将24只长耳大白兔随机分为正常组、模型组、治疗组，每组8只。正常组和模型组给予蒸馏水灌胃，治疗组给予鹿角壮骨胶囊灌胃，治疗4周后采用ELISA法检测血清IL-6、MMP-3的含量，免疫组化法检测各组兔膝关节软骨IL-6、MMP-3的表达。结果  模型组、治疗组血清IL-6、MMP-3水平高于正常组，治疗组血清MMP-3水平低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）。模型组和治疗组膝关节软骨IL-6、MMP-3表达高于正常组，治疗组IL-6、MMP-3低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论  鹿角壮骨胶囊可通过抑制IL-6、MMP-3等致炎因子的表达起到防治膝骨关节炎的作用。
　　关键词：膝骨关节炎;鹿角壮骨胶囊;血清;白介素-6;金属基质蛋白酶;关节软骨
　　中图分类号：R684.3                                文献标识码：A                                  DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.01.020
　　文章编号：1006-1959（2020）01-0061-03
　　Effects of Lujiao Zhuanggu Capsule on Serum and Cartilage IL-6 and MMP-3
　　in Rabbits with Knee Osteoarthritis
　　LIANG Zi-cong1，2，3，WANG Heng1，HU Xian-yun1，JIANG Yong2，HU Jian-shan2，3，LU Rui-na4，LIU Yun-lin4
　　（1.Department of Basic Medicine，Qiannan Medical College for Nationalities，Duyun 558000，Guizhou，China;
　　2.Department of Orthopaedics，Qiannanzhou Traditional Chinese Medicine Hospital，Duyun 558000，Guizhou，China;
　　3.Department of Traditional Chinese Medicine，Sandu Aishan Hospital，Sandu 558100，Guizhou，China;
　　4.Qiannanzhou People's Hospital/Department of Ultrasound，the First Affiliated Hospital of Qiannan Medical College，
　　Duyun 558000，Guizhou，China）
　　Abstract：Objective  To investigate the effects of Lujiao Zhuanggu Capsule on serum and cartilage IL-6 and MMP-3 in rabbits with knee osteoarthritis. Methods  The rabbit knee osteoarthritis model was induced by papain injection into the right knee joint cavity. 24 long-eared white rabbits were randomly divided into normal group， model group and treatment group， 8 in each group. The normal group and the model group were administrated with distilled water. The treatment group was administrated with Lujiao Zhuanggu Capsule. After 4 weeks of treatment， the levels of IL-6 and MMP-3 in serum were detected by ELISA. Expression of IL-6 and MMP-3. Results  The serum levels of IL-6 and MMP-3 in the model group and the treatment group were higher than those in the normal group，the difference was statistically significant （P<0.05）; the serum MMP-3 levels in the treatment group were lower than the model group，the difference was statistically significant （P<0.05）; the expression of IL-6 and MMP-3 in rabbit knee joint cartilage was higher in the model group and the treatment group than in the normal group，the difference was statistically significant（P<0.05）; IL-6 and MMP-3 in the treatment group were lower than the model group， the difference was statistically significant（P<0.05）.Conclusion  Lujiao Zhuanggu Capsule can prevent knee osteoarthritis by inhibiting the expression of IL-6， MMP-3 and other inflammatory factors. 　　Key words：Knee osteoarthritis;Lujiao Zhuanggu Capsule;Serum;Interleukin-6;Metal matrix protease; Articular cartilage
　　膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是一种好发于中老年人的慢性退行性骨关节病，临床以关节疼痛、肿胀、僵硬为主要症状[1]。KOA发病机制十分复杂，目前研究认为KOA发病与遗传、细胞因子、基质金属酶蛋白酶（matrix metaloprotease，MMPs）降解反应、软骨细胞凋亡等因素密切相关[2]。非甾体类抗炎药虽然能改善患者临床症状，但其引起的不良反应也给患者身体带来严重的危害[3]。KOA属于中医中的“痹症”范畴，中医药治疗KOA有其独特的优势，不良反应少。鹿角壮骨胶囊是我院研制的中成药制剂，具有补益肝肾、祛风散寒、强壮筋骨的作用，在治疗KOA方面具有较好的疗效。本研究主要探讨鹿角壮骨胶囊对KOA模型兔血清及软骨IL-6、MMP-3的影响，为鹿角壮骨胶囊治疗KOA提供实验支撑。
　　1材料与方法
　　1.1实验动物与分组  选取普通级4月龄日本长耳白兔24只，均为雌兔，体质量（2.0±0.5）kg，由长沙天勤生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK（湘）2014-0010。适应性饲养1周，分笼饲养，不限制饮食。按照随机数字表法分为正常组、模型组、治疗组，每组8只。
　　1.2仪器   JA10002型电子天平（上海精天）;DDIL-5型恒温箱（上海安亭）;ASP300 S型全封闭式组织脱水机、RM2265型全自动轮转式切片机、HI1210型摊片机、DM750型光学显微镜（德国Leica），MR-96A型酶标仪（深圳迈瑞）。
　　1.3药品与试剂  鹿角壮骨胶囊由黔南州中医医院制剂科提供（批准文号：黔药制2013003号，规格：0.45 g/粒），木瓜蛋白酶（北京索莱宝科技有限公司），IL-6、MMP-3 ELISA试剂盒（北京诚林生物科技有限公司），封闭液（武汉博士德生物工程有限公司），IL-6、MMP-3抗体（北京百奥思科生物医学技术有限公司），通用型SP试剂盒、DAB显色盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），4%多聚甲醛、二甲苯、乙醇、脱钙液由黔南州人民医院病理科提供，其余试剂均为国产分析纯。
　　1.4方法
　　1.4.1造模  三组分别行腹腔注射麻醉后，右侧膝关节备皮消毒。正常组注射0.5 ml灭菌注射用水。模型组与治疗组分别用针尖在内侧膝眼进针，确认进入膝关节腔，缓慢注射4%木瓜蛋白酶溶液0.5 ml。各组被动屈伸右侧膝关节20次，促进溶液在关节腔内均匀扩散。
　　1.4.2治疗方法  首次注射后第2周，治疗组给予鹿角壮骨胶囊药粉0.3 g/kg（参照成人和实验动物等效剂量换算[4]），称取体重的相应剂量，用蒸馏水稀释成10 ml后灌胃，1次/d，连续给药4周。正常组、模型组给予10 ml蒸馏水灌胃。
　　1.5观察指标  比较三组血清IL-6、MMP-3水平及其免疫组化表达。
　　1.5.1血清IL-6、MMP-3含量检测  末次给药第2天，麻醉处死所有实验动物。股动脉取血，以3000 r/min离心15 min，留取上清液，采用ELISA法以酶标仪检测各组大鼠血清中IL-6、MMP-3水平，严格按照试剂盒说明书操作。
　　1.5.2免疫组化表达  二甲苯透明脱蜡，修复抗原，PBS冲洗。滴加一抗（稀释浓度：IL-6、MMP-3为1∶200），洗去一抗，滴加二抗，滴加辣根酶标记，DAB显色，复染，封片。光学显微镜下摄片观察。每张切片摄取3个视野（×400）。运用Image-Pro Plus 6.0专业图像分析软件分析，计算指标平均光密度值。
　　1.6统计学方法  采用SPSS 22.0统计软件进行数据处理。采用Shapiro-Wilk法作正态性检验，符合正态分布的计量资料以（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，方差齐时采用LSD-t检验，方差不齐时选择Tamhane法进行分析。不符合正态分布时选择秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
　　2结果
　　2.1三组血清IL-6、MMP-3水平比较  模型组、治疗组兔血清IL-6、MMP-3水平高于正常组，治疗组兔血清MMP-3水平低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。
　　2.2三组膝关节IL-6、MMP-3免疫组化表达比较  模型组和治疗组兔膝关节软骨IL-6、MMP-3表达高于正常组，治疗组IL-6、MMP-3低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05），见表2、图2。
　　3讨论
　　KOA在中医学中有“膝痹”“鹤膝风”之称。《素问·痹论》曰：“风、寒、湿三气杂至，合而为痹也。其风气胜者为行痹，寒气胜者为痛痹，湿气胜为着痹也……以冬遇此者为骨痹。”古代医者强调KOA的发病是由于膝关节遭受了风、寒、湿三邪侵袭，导致人体下肢经络血气受阻，引起膝关节疼痛、肿胀、关节功能障碍等临床症状[5]。当代医家结合自身临床经验，提出了对痹症病因病机新的理解。李西海等[6]认为，骨关节炎与创伤性关节炎虽同属中医学中“痹症”范畴，但两者应该区别对待，其中创伤性关节炎主要由外伤、外邪侵蚀等外因引起，而骨关节炎多发生于老年人，无明显的外伤病史，往往是内因引起;KOA病机则为“本萎标痹”，肝肾亏虚是该病发病的核心病机，由于肝肾精血日渐不足，不能濡养筋骨，从而导致慢性肌肉萎缩以及关节活动不利，久而成痹。
　　现代医学研究认为，KOA的病程离不开炎症反应导致的关节滑膜增生、软骨退变、骨质增生等病理变化。白细胞介素可通过促进各种MMPs的酶原合成、分泌和活性增强，加速基质蛋白多糖、层粘连蛋白等多种基质蛋白的降解[2]。MMPs家族能直接降解软骨的蛋白聚糖和Ⅱ型胶原，导致关节软骨纤维结构遭到破坏，弹性丧失，还能令细胞外基质分解，降低软骨细胞的保护能力，引起软骨细胞死亡[7]。本院自制的鹿角壮骨胶囊以鹿角胶为君药，起到补益肝肾、填精益血、强筋壮骨之功;以骨碎补、黄芪、当归、熟地黄为臣药，起到增强君药补益肝肾之功。苏军等[8]认为鹿角胶其取自鹿角，为血肉有情之品，主归肝、肾经，具有补肝肾、益精血的功效，较植物类药物更能发挥补益肝肾之功。有研究證实[9，10]，中药骨碎补可调节Bax蛋白、Bcl-2蛋白及凋亡因子Caspase-3，从而起到抑制软骨细胞凋亡的作用，而软骨细胞的凋亡与Bax蛋白和Bcl-2蛋白的基因表达关系密切。Bax是促细胞凋亡基因，是抗细胞凋亡基因，两者作用相反，Bcl-2基因大于Bax基因时，OA软骨细胞的寿命相对延长。黄芪中有效成分包括黄芪多糖、黄芪甲苷等。黄芪多糖对炎症模型细胞所释放的炎症因子IL-6的表达具有抑制作用[11];黄芪甲苷能通过上调ECM-receptor interaction信号通路，发挥拮抗软骨细胞凋亡、降低ECM降解的作用，促使细胞分泌胶原，实现对软骨细胞外基质的修复作用[12]。有研究表明[13]，当归能抑制大鼠炎症模型关节滑膜与血浆中致炎因子IL-6、MMP-3的表达。本研究结果显示，模型组、治疗组兔血清IL-6、MMP-3水平高于正常组，治疗组兔血清MMP-3水平低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）;模型组和治疗组兔膝关节软骨IL-6、MMP-3表达高于正常组，差异有统计学意义（P<0.05）;治疗组IL-6、MMP-3低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05），说明鹿角壮骨胶囊可以降低兔膝关节血清MMP-3、IL-16的含量，有利于抑制滑膜炎症，抑制软骨细胞的凋亡、降低ECM的降解、促进Ⅱ型胶原的合成、提高蛋白黏多糖的表达。 　　综上所述，鹿角壮骨胶囊可通过抑制IL-6、MMP-3致炎因子的表达起到防治KOA的作用。
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　　收稿日期：2019-11-05;修回日期：2019-11-15
　　编辑/杜帆
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