一款固体饮料的体外活性及其对斑马鱼肠道健康改善作用的评价

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　　摘要 以药食同源中药、益生元、益生菌以及谷、蔬、果、藻粉等为主要原料研发出一款固体饮料，研究其体外抗氧化活性和改善肠道健康功能作用。通过体外抗氧化试验研究模型，测定该款固体饮料清除DPPH自由基、超氧阴离子自由基、羟基自由基的能力及对Fe3+的总还原力，最后通过斑马鱼模型观察该产品对斑马鱼肠道健康的改善作用。结果表明该款固体饮料具有优异的还原力、自由基清除作用及抗氧化能力，同时对斑马鱼的肠蠕动有显著促进作用，有助于改善肠道健康。
　　关键词 固体饮料，抗氧化活性，斑马鱼，肠蠕动，肠道健康
　　中图分类号 TS275.4文献标识码 A
　　文章编号 0517-6611（2020）06-0148-04
　　Abstract This paper mainly studied the antioxidant activity in vitro and the zebrafish intestinal health protection of the solid beverage，which is developed based on homology of medicine and food，prebiotics，probiotics and grain flour，vegetable powder，fruit powder and algae powder.On the basis of model of antioxidant activity in vitro， we measured the scavenging ability of the solid beverage on DPPH free radical，superoxide anion radical，hydroxyl radical and the total reducing power of Fe3+.Finally，the improvement effect of the product on the intestinal health of zebrafish was observed by zebrafish model.The solid beverage has excellent reducing power，free radicalscavenging capacity and antioxidant capacity，at the same time，it can promote intestinal peristalsis of zebrafish significantly，which is helpful for improving intestinal health.
　　Key words Solid beverage，Antioxidant activity，Zebrafish，Intestinal peristalsis，Intestinal health
　　隨着社会飞速发展，人们的生活方式和饮食结构正发生着巨大的变化[1]，长时间疲劳，不合理膳食和不规范生活习惯等，容易引发多种慢性疾病及亚健康状态，具体表现在胃肠道功能紊乱、胃肠道微生态失衡，免疫力下降，过氧化损伤等，此时就涉及到营养干预、倡导健康的生活方式及饮食规律，这对亚健康、慢性病的预防与治疗起到关键性的作用。人体免疫系统完善，则机体和谐、健康，反之机体受损，表现为易感染或者易生病状态[2]。“民以食为天”，中国传统文化讲究食疗、温补，多种药食同源中药以及谷、蔬、果、藻粉等健康食材富含粗多糖、花青素、总黄酮、多酚、VC、VE等抗氧化活性物质，能清除人体内自由基，起到良好的抗氧化、抗衰老、增强免疫力和保护器官的作用，同时能促进肠道蠕动，调理肠道健康。
　　斑马鱼（Zebrafish）是一种常见的热带鱼，生长在印度、巴基斯坦淡水河流中，物种稳定、繁殖周期短、体外受精、产卵量大、胚胎透明、养殖方便，斑马鱼与人类基因有80%以上的同源性，因此斑马鱼在生物学中逐渐被用于人类各脏器功能和疾病的研究[3]，是疾病模型建立、毒理学评价和药物筛选等研究领域的试验动物“新星”[4]。胃肠运动的功能与食物的消化、吸收、胃肠道健康及大便排泄有着密切的关系[5]。斑马鱼肠道细胞与人类相似，具有消化液分泌、消化、蠕动、吸收等功能，现已成功建立斑马鱼肠动力模型。以尼罗红作为标记物，设置样品组，阳性多潘立酮对照组及正常对照组，通过计算斑马鱼肠道内尼罗红的荧光强度来评价样品对斑马鱼肠蠕动促进作用的试验模型已经非常成熟。
　　该试验通过体外抗氧化模型研究一款固体饮料的抗氧化活性，通过斑马鱼肠动力模型，探讨该款固体饮料对斑马鱼肠道健康的保护作用，以期为进一步探讨其对肠道健康的保护机制提供参考。
　　1 材料与方法
　　1.1 试验动物
　　野生型AB品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行，年龄为受精后5 d，均来自于杭州环特生物科技股份有限公司。以上斑马鱼均饲养于28 ℃的养鱼用水中（水质：每1 L反渗透水中加入200 mg速溶海盐，电导率为480～510 μs/cm，pH为6.9～7.2，硬度为53.7～71.6 mg/L。试验动物使用许可证号为SYXK（浙）2012-0171，饲养管理符合国际AAALAC认证的要求。
　　1.2 材料与试剂
　　试验用固体饮料，浅粉色粉末，宁波御坊堂生物科技有限公司自制，20 ℃阴凉柜保存。用10% DMSO配制成20 mg/mL母液，用养鱼用水按需稀释，现配现用，多潘立酮，白色片剂，购自西安杨森制药有限公司，用DMSO配制成浓度为10 mg/mL的母液，-20 ℃保存，临用时用DMSO按需稀释。工作液中含1%DMSO，甲基纤维素（AR，Aladdin，中国上海），尼罗红Nile Red（N3013-100MG，Sigma，美国），无水乙醇、VC、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼、邻苯三酚、水杨酸钠、硫酸亚铁、过氧化氢、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、三羟基氨基甲烷、铁氰化钾、三氯化铁、盐酸（AR，Sinopharm，中国上海），H2O均为双蒸水。 　　1.3 仪器与设备
　　紫外可见光分光光度计（TU-1810，PGENERAL，中国），水浴式恒温摇床（OLB-110X50，OLABO，中国），解剖显微镜（SZX7，OLYMPUS，日本），与显微镜相连的相机（TK-C1481EC），精密电子天平（CP214，OHAUS，美国），荧光显微镜（AZ100，NIKON，日本），六孔板（Nest Biotech，中国）。
　　1.4 试验分组
　　根据浓度摸索试验，该款固体饮料在所设各浓度下均不诱发斑马鱼死亡，且无明显毒性表型。因此，确定该款固体饮料对斑马鱼的最大耐受浓度（MTC）为2 000 μg/mL。将斑马鱼分为5组，正常对照组（仅给予尼罗红）、阳性对照组（多潘立酮 30 μg/mL）、低剂量组（固体饮料 222 μg/mL，1/9MTC）、中剂量组（固体饮料 667 μg/mL，1/3MTC）、高剂量组（固体饮料 2 000 μg/mL，MTC）。
　　1.5 試验方法
　　1.5.1 清除DPPH自由基能力的测定[6]。取2 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液，加入1 mL待测样品及1 mL H2O混匀，常温反应30 min，在517 nm处测定样品吸光值Ai。空白组用H2O代替样品，其余操作同样品组，测得空白组吸光值A0。VC作为阳性对照，其清除率计算公式为：
　　清除率=A0-AiA0×100%
　　1.5.2 清除超氧阴离子自由基能力的测定[7]。
　　取pH为8.2的Tris-HCl缓冲溶液4.5 mL，加入4.2 mL H2O，混匀后于25 ℃恒温水浴中保温20 min，同时将样品和25 mmol/L邻苯三酚溶液一起放入25 ℃水浴中预热。保温20 min后加入1 mL待测样品及0.4 mL邻苯三酚溶液，迅速混匀后于25 ℃下反应5 min，之后加入1 mL 8 mmol/L的HCl终止反应，于320 nm处测得样品吸光值Ai。空白组用H2O代替样品，其余操作同样品组，测得空白组吸光值A0。VC作阳性对照，其清除率计算公式为：
　　清除率=A0-AiA0×100%
　　1.5.3 清除羟基自由基能力的测定[8]。
　　取10 mmol/L水杨酸钠-乙醇溶液、10 mmol/L FeSO4溶液、待测样品各1 mL，混匀后37 ℃恒温水浴反应30 min，之后加入1 mL 8.8 mmol/L的H2O2溶液终止反应，于510 nm处测得样品吸光值Ai。空白组用H2O代替样品，其余操作同样品组，测得空白组吸光值A0，Ai0为不加H2O2的本底吸光值。VC作为阳性对照，其清除率计算公式为：
　　清除率=Ai-Ai0A0×100%
　　1.5.4 总还原力的测定[9]。取2.5 mL 0.2 mol/L的磷酸盐缓冲溶液，2.5 mL1%的K3Fe（CN）6溶液和2 mL待测样品，混匀后50 ℃水浴保温30 min，之后加入2.5 mL H2O和0.5 mL 0.1%的FeCl3溶液，混匀，于700 nm处测得样品吸光值Ai。空白组用H2O代替样品，其余操作同样品组，测得空白组吸光值A0。VC作为阳性对照，其总还原力计算公式为：
　　总还原力=Ai-A0
　　1.5.5 最大耐受浓度（MTC）的测定。随机选取210尾受精后5 d（5 dpf）的野生型AB品系斑马鱼于六孔板中，每孔（试验组）均处理30尾斑马鱼。分别水溶给予该款固体饮料 100、250、500、1 000、1 500和2 000 μg/mL浓度（终浓度含1% DMSO），同时设置正常对照组（养鱼用水处理斑马鱼），每孔（试验组）容量为3 mL。该款固体饮料处理6 h后，观察记录斑马鱼的表型和死亡情况，确定该款固体饮料对斑马鱼的MTC。
　　1.5.6 对肠蠕动的促进作用评价。
　　随机选取150尾受精后5 d（5 dpf）的野生型AB品系斑马鱼，水溶给予尼罗红16 h建立斑马鱼胃肠动力促进剂筛选模型。尼罗红移除后，将斑马鱼随机分配于六孔板中，每孔（试验组）均处理30尾斑马鱼。分别水溶给予该款固体饮料222、667和2 000 μg/mL浓度，阳性对照药多潘立酮30 μg/mL浓度，同时设置正常对照组，每孔（试验组）容量为3 mL。该款固体饮料处理24 h后，每个试验组随机选取10尾斑马鱼在荧光显微镜下拍照并采集数据，用NIS-Elements D 3.10高级图像处理软件进行图像分析，计算统计斑马鱼肠道内尼罗红荧光强度（S），根据统计学意义评价该款固体饮料对斑马鱼肠蠕动的促进作用。统计学处理结果用平均值±标准误差表示，该款固体饮料对斑马鱼肠蠕动的促进作用计算公式如下：
　　肠蠕动促进作用=S（正常对照组）-S（供试品组）S（正常对照组）×100%
　　用方差分析和Dunnett’s T-检验进行统计学分析，P<0.05表明具有显著性差异，提供具有代表性的试验图谱。
　　2 结果与分析
　　2.1 该款固体饮料体外抗氧化试验结果
　　2.1.1 清除DPPH自由基能力。
　　该款固体饮料和VC对DPPH自由基的清除效果见图1，由图可见两者的清除率与其浓度均表现出明显的正比关系。试验范围内测得该款固体饮料的IC50 值为825.6 μg/mL，VC的IC50值为35.2 μg/mL。结果表明该款固体饮料对DPPH自由基的清除效果较好，但低于同浓度下的VC。
　　2.1.2 清除超氧阴离子自由基能力。
　　该款固体饮料和VC对超氧阴离子自由基的清除效果见图2，由图可见两者的清除效果均与浓度呈正比。VC的IC50值为858.4 μg/mL，而该款固体饮料的IC50值为3 829.5 μg/mL，表明该款固体饮料对超氧阴离子自由基有一定的清除能力但其清除效果远低于同浓度下的VC。 　　2.1.3 清除羥基自由基能力。
　　该款固体饮料和VC对羟基自由基的清除效果如图3所示，由图可见两者的清除率均与其浓度存在明显的量效关系。VC的IC50值为221.6 μg/mL，而该款固体饮料的IC50值为2 358.6 μg/mL，表明该款固体饮料对羟基自由基具有一定的清除能力但效果低于同浓度下的VC。
　　2.1.4 总还原力。该款固体饮料和VC对Fe3+的总还原力结果如图4所示，由图可知，在一定浓度范围内，VC和该款固体饮料的总还原力随浓度增大而增强，具有明显的量效关系，但同浓度下该款固体饮料的总还原力远低于VC。
　　2.2 该款固体饮料对斑马鱼肠道健康改善作用试验结果
　　2.2.1 最大耐受浓度（MTC）。
　　该款固体饮料在100～2 000 μg/mL 浓度下，未引起斑马鱼死亡，且未产生任何明显的毒副作用（表1）。确定该款固体饮料对斑马鱼的MTC为2 000 μg/mL（此浓度为最大耐受浓度检测上限）。
　　2.2.2 对肠蠕动的促进作用。
　　正常对照组斑马鱼肠道内尼罗红荧光强度总和为456 546像素。阳性对照药多潘立酮30 μg/mL斑马鱼肠道内尼罗红荧光强度总和为167 095像素，与正常对照组比较P<0.001，对斑马鱼肠蠕动促进作用为63%，说明多潘立酮对斑马鱼肠蠕动有促进作用。该款固体饮料222、667和2 000 μg/mL浓度组斑马鱼肠道内尼罗红荧光强度总和分别为209 245、125 427和83 985像素，肠蠕动促进作用分别为54%、73%和82%，与正常对照组比较，222、667和2 000 μg/mL浓度组均P<0.001，表明固体饮料在222、667和2 000 μg/mL浓度条件下均能显著促进斑马鱼肠蠕动（表2、图5～7）。
　　3 结论与讨论
　　活性氧能够引起细胞的抗氧化系统失控，造成氧化胁迫和氧化损伤[10]，比如说破坏核酸DNA、RNA，修饰氨基酸、使肽链断裂，使酶失活，损害生物膜，导致细胞衰老和死亡，加速人体老化进程等。该款固体饮料采用多种药食同源中药以及谷、蔬、果、藻粉制成，其中的主要原料来源于苹果[11]、甘蓝[12]、西兰花[13]、苦瓜[14]、荷叶[15]、绿茶[16]、蓝莓[17]等，其富含花青素、总黄酮、多酚、VC、VE等抗氧化活性物质，能清除人体内自由基，起到良好的抗氧化、抗衰老和保护器官的作用。该款固体饮料采用的益生元低聚果糖具有润肠通便、提高肠
　　道蠕动、改善肠道健康的作用[18]。试验通过体外活性评价模型试验结果的分析，总结出此款固体饮料的体外抗氧化活性低于同浓度的VC，其对DPPH自由基和羟基自由基具有较好的清除能力，对超氧阴离子自由基的清除能力较弱，对Fe3+有一定的还原能力。证实此款固体饮料具有一定的体外抗氧化活性，其活性具有明显的量效关系，说明它具有
　　较好的抗氧化作用。该研究利用野生型AB品系斑马鱼，水溶给予尼罗红16 h建立起斑马鱼肠动力促进剂筛选模型，给予不同浓度样品，设置阳性对照及正常对照组处理24 h，选取斑马鱼在荧光显微镜下拍照并采集数据，计算斑马鱼肠道内尼罗红的荧光强度，根据荧光强度的统计学意义评价此款固体饮料对斑马鱼肠蠕动的促进作用。试验结果表明此款固体饮料对斑马鱼肠蠕动有显著的促进作用，反映出其对肠道健康具有良好的改善作用。综上所述，此款固体饮料不仅具有良好的抗氧化作用，有利于延缓机体的氧化损伤及衰老，而且还具有改善肠道健康状况的作用。
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