复方浙贝浸膏联合奥沙利铂对人结肠癌耐奥沙利铂移植瘤及细胞膜耐药相关蛋白表达的影响

来源:用户上传      作者:吕鹏 赵欢 石凤芹 陈信义 侯丽

　　摘要：目的  觀察复方浙贝浸膏（CZBE）联合奥沙利铂（L-OHP）对人结肠癌耐奥沙利铂细胞株HCT116/L-OHP移植瘤小鼠的抑瘤作用，以及对移植瘤细胞耐药相关蛋白MDR1、MRP1及LRP5表达的影响。方法  将人结肠癌耐奥沙利铂细胞株HCT116/L-OHP细胞接种于Balb/C裸鼠右前腋皮下构建人结肠癌耐L-OHP移植瘤模型，成模后按随机数字表法将移植瘤小鼠分成模型组、L-OHP组（L-OHP 3 mg/kg）、CZBE高剂量（CZBE 10 g/kg）联合L-OHP组、CZBE中剂量（CZBE 5 g/kg）联合L-OHP组、CZBE低剂量（CZBE 2.5 g/kg）联合L-OHP组。分组当日开始给药，CZBE灌胃给药，每日1次;L-OHP腹腔注射，隔日1次。连续给药2周。实验结束后处死小鼠，称重后完整剥离瘤体并称瘤质量，计算肿瘤抑制率。将瘤块组织制成切片，免疫组化检测HCT116/L-OHP移植瘤细胞膜耐药相关蛋白表达。结果  各剂量CZBE联合L-OHP均可有效抑制HCT116/L-OHP裸鼠移植瘤的增长。L-OHP组肿瘤抑制率为27.239%，CZBE高剂量联合L-OHP组肿瘤抑制率为45.031%，与L-OHP组比较差异有统计学意义（P<0.05），CZBE中剂量联合L-OHP组肿瘤抑制率为37.669%，CZBE低剂量联合L-OHP组肿瘤抑制率为32.147%。与模型组比较，L-OHP组移植瘤细胞MDR1、MRP1、LRP5的IOD/Area值差异无统计学意义（P>0.05）;与模型组及L-OHP组比较，各剂量CZBE联合L-OHP组移植瘤细胞MDR1、MRP1、LRP5蛋白表达量均不同程度降低，其中，CZBE中、高剂量联合L-OHP组移植瘤细胞MDR1、MRP1蛋白表达量明显降低，差异有统计学意义（P<0.05），CZBE高剂量联合L-OHP组移植瘤细胞LRP5蛋白表达明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。结论  CZBE联合L-OHP可提高人结肠癌耐L-OHP细胞株移植瘤的肿瘤抑制率，其机制可能是通过减少人结肠癌耐L-OHP细胞膜耐药相关蛋白表达，增加结肠癌细胞对化疗药物的敏感性，从而起到协同增效作用。
　　 关键词：复发浙贝浸膏;结肠癌;细胞增殖;多药耐药
　　 中图分类号：R285.5    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2020）02-0043-05
　　 DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201907434
　　Effects of Compound Zhebei Extract Combined with Oxaliplatin on Oxaliplatin-resistant Human Colon Cancer Cells and the Expression of Drug Resistance-related Proteins
　　LYU Peng， ZHAO Huan， SHI Fengqin， CHEN Xinyi， HOU Li
　　Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100700， China
　　Abstract： Objective To observe the anti-tumor effect of compound Zhebei Extract （CZBE） combined with oxaliplatin （L-OHP） on human colon cancer cell line HCT116/L-OHP transplanted tumor in mice， and its effects on the expressions of MDR1， MRP1 and LRP5 in transplanted tumor cells. Methods Human colon cancer L-OHP-resistant transplanted tumor model was established by inoculating human colon cancer Oxaliplatin-resistant cells （HCT116/L-OHP） under the right anterior axillary skin of Balb/C nude mice. After the successful establishment of the model， the transplanted mice were divided into five groups according to random number table method： model group， L-OHP group （3 mg/kg L-OHP）， CZBE high-dosage （10 g/kg） combined with L-OHP group， CZBE medium-dosage （5 g/kg） combined with L-OHP group， CZBE low-dosage （2.5 g/kg） combined with L-OHP group. Medication was conducted once the groups were divided. CZBE was given through gavage， once a day; L-OHP was injected intraperitoneally once every other day for 2 weeks. At the end of the experiment， mice were executed， weighed， and the tumors were removed completely， and the tumor inhibition rate was calculated. Tumor tissue was sliced. Immunohistochemistry was used to detect the expressions of drug resistance-related proteins in HCT116/L-OHP transplanted tumor cells. Results CZBE combined with L-OHP could effectively inhibit the growth of HCT116/L-OHP xenografts in nude mice. The tumor inhibition rate of L-OHP group was 27.239%， and that of CZBE high-dosage combined with L-OHP group was 45.031%， which was significantly different from L-OHP group （P<0.05）. The tumor inhibition rate of CZBE medium-dosage combined with L-OHP group was 37.669%， that of CZBE low-dosage combined with L-OHP group was 32.147%. Compared with the model group， there was no statistical significance in the IOD/Area values of MDR1， MRP1 and LRP5 in L-OHP group （P>0.05）. Compared with model group and L-OHP group， the IOD/Area values of MDR1， MRP1 and LRP5 of transplanted tumor cells in each dosage combination group decreased in varying degrees. The IOD/Area values of MDR1 and MRP1 in the medium- and high-dosage combination groups decreased significantly， with statistical significance （P<0.05）， while the IOD/Area values of LRP5 in the high-dosage combination group decreased significantly， with statistical significance （P<0.05）. Conclusion CZBE combined with L-OHP can improve the tumor inhibition rate of transplanted human colon cancer L-OHP resistant cell lines. The mechanism may achieve synergistic effect by reducing the expression of L-OHP cell membrane resistance-related proteins in human colon cancer and increasing the sensitivity of colon cancer cells to chemotherapeutic medicine. 　　 Keywords： Compound Zhebei Extract; colon cancer; cell proliferation; multidrug resistance
　　 结直肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，就诊时多数已属中晚期，死亡率较高[1-2]。晚期结直肠癌术前同步放化疗、新辅助放化疗及术后辅助化疗中加用奥沙利铂可以提高局部缓解率，但由于对奥沙利铂耐药等因素，远期预后改善有限[2-3]。中医药在晚期结直肠癌围化疗期中具有协同增效、逆转多药耐药的独特优势[4]。复方浙贝浸膏（CZBE）是北京中医药大学东直门医院血液肿瘤科根据晚期恶性肿瘤临床特点组方，由浙贝母、川芎、汉防己（1∶1∶1）3味中药组成，方中浙贝母化痰散结，川芎行气活血化瘀，汉防己利湿消肿以截生痰之源。课题组前期体外细胞实验显示，复方浙贝药物血清高、中、低剂量组对HCT-116细胞增殖抑制率分别为40.00%、42.37%和29.15%，细胞凋亡率分别为18.75%、20.00%、15.32%，均高于对照组（P<0.05），能通过调节P53通路抑制HCT-116细胞增殖、促其凋亡[5]。但CZBE对结直肠癌体内抗肿瘤机制研究尚未开展。本实验研究通过构建人结肠癌耐奥沙利铂小鼠移植瘤模型，从体内观察CZBE对耐奥沙利铂结直肠癌细胞的抑制作用及细胞膜耐药相关蛋白表达的影响，进一步丰富CZBE对结肠癌的疗效及作用机制。
　　1  实验材料
　　1.1  药物
　　 CZBE，棕褐色粉末，药物密封，避光阴凉处保存，水溶解性好，北京中医药大学东直门医院中药房提供，批号17102504P，实验前用双蒸水配成混悬液，冰箱冷藏避光保存。注射用奥沙利铂，冻干型，江苏恒瑞医药股份有限公司，规格100 mg/瓶，类白色疏松状粉末，批号170809AG。用无菌5%葡萄糖注射液稀释至使用浓度。
　　1.2  细胞株及动物
　　 人结肠癌耐奥沙利铂细胞株HCT116/L-OHP，中国中医科学院常规保存。雄性Balb/C裸鼠，15～17 g，SPF级，斯贝福（北京）实验动物科技有限公司提供，动物许可证号SYXK（京）2014-0003，實验全过程在具屏障系统动物饲养室内完成，动物饲养室实验设施合格证号SYXK（京）2002-0016。饲养室温20～25 ℃、日温差≤3 ℃，相对湿度40%～60%，光照12 h明暗交替，空气洁净度为100级，氨浓度≤14 mg/m3，噪声≤60 db，工作照度为150～300 L，动物照度为100～200 Lx。鼠食用灭菌鼠饲料，北京科澳协力饲料有限公司。小鼠自由饮用过滤消毒水。
　　1.3  主要试剂与仪器
　　 0.9%氯化钠注射液，华润双鹤药业股份有限公司，批号F201611075;无水乙醇（分析纯），北京北化精细化学品有限责任公司，批号20170727;5%葡萄糖注射液，华润双鹤药液股份有限公司，批号F201812112。HRP-山羊抗小鼠（Servicebio，货号GB23301）。医用净化工作台，CJ-2F型，净化等级100级（美国联邦标准209E），苏州市冯氏实验动物设备有限公司，librorEB-280型分析天平;82-1型电动离心机，奥豪斯电子精密天平，量程0.01～510 g，美国OHAUS Corp;日本NIKON倒置显微镜、Olympus/PM-6显微镜;电子数显卡尺，桂林广陆数字测控股份有限公司，型号SF2000，分辨率0.01 mm，规格0～150 mm，标准GB/T14899-94;病理切片机，上海徕卡仪器有限公司，型号RM2016;烤片机，天津天利航空机电有限公司，型号KPJ-1A/11030574;摊片机，浙江金华科迪仪器设备有限公司，型号KD-P。
　　2  实验方法
　　2.1  造模
　　 ①细胞培养：HCT116/L-OHP细胞用10%胎牛血清、1%双抗RPMI1640完全培养基，于37 ℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内培养，2～3 d换液1次。②接种：收集对数生长期细胞，1000 r/min离心5 min，无血清RPMI1640培养液稀成浓度为6×107个/mL细胞悬液，每只鼠右前腋皮下接种6×106个细胞，即0.1 mL细胞悬液。
　　2.2  分组和给药
　　 成瘤后，将移植瘤裸鼠随机分为5组，即模型组、L-OHP组（3 mg/kg L-OHP腹腔注射，隔日1次）、CZBE高剂量联合L-OHP组（CZBE 10 g/kg灌胃，每日1次;L-OHP 3 mg/kg腹腔注射，隔日1次）、CZBE中剂量联合L-OHP组（CZBE 5 g/kg灌胃，每日1次;L-OHP 3 mg/kg腹腔注射，隔日1次）、CZBE低剂量联合L-OHP组（CZBE 2.5 g/kg灌胃，每日1次;L-OHP 3 mg/kg腹腔注射，隔日1次），每组10只。连续给药2周。实验开始后每3 d用卡尺测皮下瘤长径和短径。
　　2.3  瘤质量及肿瘤抑制率
　　 末次给药后约6 h，颈椎脱臼法处死小鼠，称体质量后完整剥离小鼠移植瘤组织，测量各组小鼠肿瘤体积并称重，根据瘤质量计算肿瘤抑制率。肿瘤抑制率=[1-（实验组瘤质量÷模型组瘤质量）]×100%。
　　2.4  多药耐药相关酶检测
　　 免疫组化检测各实验组移植瘤组织细胞MDR1、MRP1、LRP5表达，步骤：①将各实验组瘤块组织进行石蜡包埋，脱蜡脱水，采用免疫组化SP二步法（严格按试剂盒说明书操作），抗原热修复3 min，切片浸入0.01 mol/L PBS洗涤3次×2 min，滴加3%H2O2，10～15 min，0.01mol/L PBS洗涤3次×2 min，滴加一抗，37 ℃湿盒孵育90 min，0.01 mol/L PBS洗涤3次×2 min，滴加二抗（生物素标记辣根过氧化物酶标记抗鼠IgG抗体），37 ℃湿盒孵育90 min。0.01 mol/L PBS洗涤3次×2 min，DBA显色剂显色15 min，自来水冲洗，苏木精复染，中性树胶封固，用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照;②TopⅡ和GST判定标准：TopⅡ及GST染色阳性物质主要定位于细胞浆及细胞核，呈棕黄色颗粒为阳性细胞，应用Image ProlPus 7.0免疫组化彩色图像分析系统对免疫组化染色结果进行定量分析，以对照组阳性点为基础，对视野统一测定参数，分析实验各组图片阳性点积分光密度与细胞分布区域面积之比（IOD/Area）反映免疫组化图片中目标蛋白平均表达量。 　　3  统计学方法
　　 采用SPSS21.0和Grapad Prism 7.0统计软件进行分析。计量资料以—x±s表示，均数间比较采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
　　4  结果
　　4.1  实验动物瘤质量及肿瘤抑制率比较
　　 实验过程中各组小鼠皮下移植瘤持续增长，其中模型组小鼠瘤体积生长最快，其他依次为L-OHP组、CZBE低剂量联合L-OHP组、CZBE中剂量联合L-OHP组、CZBE高剂量联合L-OHP组。CZBE联合L-OHP对人结肠癌耐奥沙利铂细胞株具有显著抑制作用。CZBE高剂量联合L-OHP组肿瘤抑制率为45.03%，与阳性药L-OHP组比较差异显著（P<0.05），CZBE中剂量联合L-OHP组肿瘤抑制率为37.67%，CZBE低剂量联合L-OHP组肿瘤抑制率为32.15%，L-OHP组肿瘤抑制率为27.24%，见表1。
　　4.2  免疫组织化检测结果
　　 标记的MDR1、MRP1、LRP5呈棕黄色，主要存在于细胞浆及细胞膜中。显微镜放大400倍显示，模型组及L-OHP组可见较多的MDR1、MRP1、LRP5表达细胞，差异均无统计学意义（P>0.05）。CZBE各剂量联合L-OHP组移植瘤细胞MDR1、MRP1、LRP5表达减少;其中，与模型组及L-OHP组比较，CZBE中、高剂量联合L-OHP组移植瘤细胞MDR1、MRP1表达明显降低，差异有统计学意义（P<0.05），CZBE高剂量联合L-OHP组移植瘤细胞LRP5表达明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见图1～图3。
　　4.3  复方浙贝浸膏联合奥沙利铂对移植瘤细胞MDR1、MRP1、LRP5蛋白表达的影响
　　 与模型组比较，L-OHP组移植瘤细胞MDR1、MRP1、LRP5蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05）;与模型组、L-OHP组比较，CZBE各剂量联合L-OHP组移植瘤细胞MDR1、MRP1、LRP5蛋白表達降低，CZBE中、高剂量联合L-OHP组移植瘤细胞MDR1、MRP1蛋白表达差异有统计学意义（P<0.05），CZBE高剂量联合L-OHP组移植瘤细胞LRP5蛋白表达差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。
　　5  讨论
　　 多药耐药性是指肿瘤细胞对一种化学治疗药物产生耐药后，对未经接触的、结构和功能各异的多种抗肿瘤药物也产生交叉耐药的现象，是目前阻碍化学治疗实施、影响联合化学治疗效果的一大障碍。多药耐药相关蛋白（MRP）家族由MRP1～MRP9共9个成员组成，可通过细胞膜转运多种抗肿瘤药物，从而限制肿瘤药物进入细胞发挥抗肿瘤作用。在结肠癌组织中，其表达与MDR1、LRP5表达呈显著正相关，MDR1、MRP1、LRP5的高表达是结肠癌临床缓解率低、转移风险增加的独立危险因素，降低MDR1、MRP1、LRP5的表达逆转结肠癌多药耐药[6-8]。
　　 中医药在晚期恶性肿瘤的多学科综合治疗模式中具有增效减毒的独特优势，肿瘤积聚及多药耐药的难治特点符合中医“顽痰”反复难治的特征[9]，《灵枢·百病始生》“凝血蕴裹而不散，津液涩渗，着而不去，而积皆成矣”奠定了血瘀津停、痰瘀互结肿瘤病机的基础。痰瘀作为临床常见的致病因素和病理产物，与肿瘤的发生、发展、侵袭和转移密切相关，化痰祛瘀法为中医防治肿瘤复发转移的常用治疗法则[10-12]。CZBE方中浙贝母化痰散结，川芎行气活血化瘀，汉防己利湿消肿以截生痰之源，共奏活血化痰散结之效。课题组前期体外细胞实验显示，CZBE能抑制人结肠癌HCT-116细胞增殖、促其凋亡[5]。
　　 本研究通过体内实验究表明，CZBE各剂量联合L-OHP均能有效抑制HCT116/L-OHP裸鼠移植瘤体积的增长。CZBE高剂量联合L-OHP组肿瘤抑制率为45.031%，与L-OHP组比较差异有统计学意义（P<0.05）。与模型组比较，L-OHP组移植瘤细胞MDR1、MRP1、LRP5蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05）;与模型组、L-OHP组比较，CZBE各剂量联合L-OHP组移植瘤细胞MDR1、MRP1、LRP5蛋白表达均降低，CZBE中、高剂量联合L-OHP组移植瘤细胞MDR1、MRP1差异有统计学意义（P<0.05），CZBE高剂量联合L-OHP组移植瘤细胞LRP5差异有统计学意义（P<0.05）。本研究表明，CZBE联合L-OHP能有效抑制人耐奥沙利铂结肠癌细胞株裸鼠移植瘤的增长，提高抑瘤率，其机制可能是通过减少移植瘤细胞膜耐药相关蛋白MDR1、MRP1、LRP5的表达，逆转肿瘤细胞多药耐药性，起到协同增效作用。结合课题组前期体外细胞实验，本研究从移植瘤裸鼠体内实验证实CZBE对于人耐奥沙利铂结肠癌的疗效及作用机制。
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　　（收稿日期：2019-07-28）
　　（修回日期：2019-08-18;编辑：华强）
　　基金项目：北京市科技计划“十病十药”研发专项（Z151100003815027）
　　通讯作者：侯丽，E-mail：houli1203@126.com
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