液相色谱-高分辨质谱测定贝类中虾夷扇贝毒素
来源:用户上传
作者:吴祥庆 杨姝丽 余焘
摘要 [目的]建立贝类产品中虾夷扇贝毒素（YTX）的液相色谱-四极杆-静电轨道场离子阱高分辨质谱检测方法。[方法]以牡蛎和文蛤为研究对象，样品经甲醇提取，采用QuEChERS净化，经Hypersil GOLD C18色谱柱分离，乙腈和0.002 mol/L甲酸铵溶液（含0.2%甲酸）为流动相梯度洗脱，负离子全扫描+数据依赖二级扫描，提取一级谱图中准分子离子精确质量数定量，二级质谱图中特征离子精确质量数定性。[结果]虾夷扇贝毒素（YTX）在12 min内出峰，定量限为0.3 μg/kg，在9.05～181.00 μg/L范围内线性良好，相关系数r=0.996 4，回收率96.3%～102.8%，相对标准偏差（RSD）小于14.2%（n=6）。[结论]该研究为贝类毒素监控提供了技术支持。
关键词 贝类毒素;虾夷扇贝毒素;液相色谱-高分辨质谱
Abstract [Objective]The research aimed to establish a method for the simultaneous determination of Yessotoxins （YTX） in shellfish by liquid chromatographyquadrupoleorbitrap mass spectrometry.[Method]Oyster and clam samples were extracted with methanol and purified with QuEChERS technology.The analytes were isolated by Hypersil GOLD C18 column and gradient eluted with acetonitrile-0.002 mol/L ammonium formate solution （0.1% formic acid）.YTX were determined by orbitrap mass spectrometry through negative ion scanning， full scan mode and data dependent scan mode.[Result]The retention time of YTX was all within 12 min.The limits of quantification （LOQ） was 0.3 μg/kg.The calibration curves showed good linearity within the concentration range of 9.05-181.00 μg/L，r=0.996 4;the average recovery rate was 96.3%-102.8% and the relative standard deviations （RSD） were less than 14.2% （n=6）.[Conclusion] The study provides technical support for the monitoring of shellfish toxins.
Key words Shelfish toxin;Yessotoxins（YTX）;Liquid chromatographyhigh resolution mass spectrometry
貝类具有非选择性滤食的习性，在海域生长过程中极易受到有毒微藻的污染。虾夷扇贝毒素是一类多环聚醚海洋微藻毒素，最基本的结构为YTX，目前发现一百余种衍生物，但具体化学结构仍未完全确定。虾夷扇贝毒素由网状原甲藻、多边舌甲藻和具刺膝沟藻产生，可大量累积在双壳贝类体内，主要分布在消化腺、胰腺等组织中。食用受虾夷扇贝毒素污染的贝类产品会对心脏、神经系统、免疫系统等造成损害[1-3]。虾夷扇贝毒素广泛分布于全球海域，对贝类产品食用安全的威胁不容忽视，欧盟第853/2004号法规规定虾夷扇贝毒素总安全限量值为1 mg/kg。
检测贝类毒素常用方法为小鼠生物法，但小鼠法不能区分贝类毒素的具体组分，准确性和灵敏度都较差，目前已逐渐被仪器检测方法取代[4-5]。液相色谱-三重四极杆质谱法是检测贝类毒素常用方法[6-8]，但由于分辨率低，贝类产品的基质复杂，容易出现假阳性结果。静电场轨道阱高分辨质谱具有分辨率和灵敏度高的特点，能够获得碎片离子的精确质量数，现在已成为研究的新热点[9-10]。该研究采用液相色谱-四极杆-静电轨道阱高分辨质谱对贝类中虾夷扇贝毒素（YTX）进行检测，采用QuEChERS技术对样品进行净化，提高了样品分析效率，为贝类毒素监控提供了技术支持，也为食品安全提供了可靠保障。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 研究对象。贝类产品为近江牡蛎、文蛤，采集自钦州七十二泾、大风江贝类养殖区。用清水冲洗干净贝类外壳，切断闭壳肌，打开外壳，用纯水冲洗泥沙等异物，取肌肉等可食用部分，作为试样，沥干后均质。冷藏运输到实验室，实验室-18 ℃保存，备用。
1.1.2 主要仪器。U3000液相色谱（美国赛默飞世尔公司）;Q Exactive四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪（美国赛默飞世尔公司）;HM100均质器（北京格瑞德曼公司）;Centrifuge 5804R离心机（德国艾本德公司）;旋涡混合器（美国talboys公司）;Synergy纯水仪（美国密理博公司）。
1.1.3 主要试剂。标准品：YTX（8.4±0.4 μg/mL），购自加拿大海洋生物科学研究所;甲醇、乙腈（色谱纯，美国赛默飞世尔公司）;甲酸（色谱纯，美国Sigma公司）;试验用水由纯水仪制备;C18、GCB、PSA、MgSO4基质分散固相萃取填料（上海安谱公司）。 1.2 方法
1.2.1 色谱条件。Hypersil GOLD C18色谱柱（1.9 μm，2.1 mm×100 mm）。流动相：A为乙腈，B为0.002 mol/L甲酸铵溶液（含0.2%甲酸）。梯度洗脱：0～1 min，30%A;1～7 min，30% A～90% A;7～10 min，90% A;10.1～12.0 min，30% A。流速0.2 mL/min。进样体积5 μL。柱温40 ℃。
1.2.2 质谱条件。离子源：电喷雾离子源（ESI）;扫描方式：负离子，一级全扫描+数据依赖二级扫描（FullMS+ddms2）;喷雾电压：3 200 V;鞘气流量：275 kPa;辅助气流量：69 kPa;离子传输管温度：320 ℃;一级扫描分辨率：70 000 FWHM;二级扫描分辨率：17 500 FWHM，归一化碰撞能量：20、40、60 eV。
1.2.3 样品前处理。准确称取2.00 g（精确到0.01 g）样品于50 mL离心管中，加入10 mL甲醇，涡旋混匀1 min，超声提取5 min，8 000 r/min离心5 min，转移上清液，残渣再用10 mL甲醇重复提取1次，离心后合并上清液，加入1 g硫酸镁、150 mg C18，漩涡混合30 s，8 000 r/min离心5 min，取10 mL上清液于50 ℃下氮吹至近干，用80%甲醇定容至1 mL，漩涡混合30 s，过0.22 μm滤膜，待仪器分析。
2 结果与分析
2.1 质谱条件的选择 根据欧盟2002/657/EC，质谱确证动物产品中的有机残留物需要4个识别点。通过高分辨质谱获得的母离子和子离子识别点分别为2.0和2.5 IPs，因此只需要获得1个母离子和1个子离子，就能满足对目标化合物的确证要求。
在该研究中，YTX采用负离子模式，选择[M-H]-作为定量离子，精确质量数理论值为1 141.471 72，实际测定值为1 141.472 29，偏差0.5×10-6，质量准确度满足要求。当定量离子强度达到8×104则触发数据依赖的二级扫描，YTX特征二级碎片离子为[M-SO3-H]-，精确质量数为1 061.518 31，实际测定值为1 061.518 31，偏差3.2×10-6，二级质谱图见图1。
提取一级全扫描的精确质量数定量，二级碎片离子定性。在同样测试条件下，样品与标准物质保留时间相对偏差在±5%以内，且检测到母离子与二级碎片离子的精确质量数与理论值相对偏差小于5×10-6，判定为阳性样品。
2.2 色谱条件的选择 该研究选用C18色谱柱，用乙腈和0.002 mol/L甲酸铵溶液（含0.2%甲酸）进行梯度洗脱，在“1.2.1”的色谱条件下，YTX在12 min内出峰，分析时间短，峰形尖锐，灵敏度高（图2）。
2.3 样品提取、净化条件的优化
2.3.1 样品提取条件的优化。根据YTX的结构、性质及相关文献资料[11-14]，通过比较提取前、后加标的回收率，考察了用乙腈、甲醇、80%甲醇的提取效果。结果发现，3种提取剂的提取率均能达到90%以上。但乙腈提取液蛋白质等杂质较多，净化效果较差;80%甲醇作为提取液在后续浓缩过程中不易吹干。因此，该研究采用甲醇作为提取剂。
2.3.2 样品净化条件的优化。QuEChERS技术是一种将固相萃取吸附剂分散到样品萃取液中吸附杂质的净化方法，广泛应用于药物残留检测中[15-16]。为降低贝类样品中大量色素、脂肪、蛋白质的影响，该研究采用QuEChERS法对提取液进行净化处理。通过在基质溶液中加标，添加不同固相萃取吸附剂，考察回收率方式，比较了C18、GCB、PSA这3种常用净化剂的效果。单独使用C18固相萃取剂时，净化效果一般;添加PSA会使YTX回收率下降，这可能是由于YTX结构中含有2个磺酰基，PSA作为碱性吸附剂对YTX吸附较强;加入GCB后色素净化效果较好，但是回收率较低。综合考虑净化效果与回收率，最终确定了使用2 g样品加入150 mg C18固相萃取剂和1 g MgSO4。
2.4 线性范围和检出限 为避免净化不完全带来的基质效应，采用基质标准曲线进行定量。取空白基质样品，按“1.2.3”样品处理方法制得基质溶液，在基质溶液中加入标准品配成浓度为9.05、18.10、45.30、90.50、181.00 μg/L的基质标准溶液，按照“1.2.1”色谱条件和“1.2.2”质谱条件上机测定。以被测组分的峰面积响应值为纵坐标、浓度为横坐标绘制标准曲线，进行线性回归，结果发现，在9.05～181.00 μg/L范围内线性良好，相关系数r=0.996 4。按照母离子信噪比（S/N）=3和S/N=10確定检出限（LOD）和定量限（LOQ），发现YTX检出限为0.1 μg/kg，定量限为0.3 μg/kg。这表明该方法完全可以满足贝类毒素日常检测的需要。
2.5 准确度、精密度 选择未检出贝类毒素的牡蛎、文蛤作为空白基质样品，分别添加3个浓度水平进行加标回收试验，每个浓度水平做6个平行样，结果见表1。从表1可以看出，在3个添加水平下虾夷扇贝毒素（YTX）的平均回收率不小于96.3%，相对标准偏差（RSD）不大于14.2%。试验结果表明，该方法的回收率和重现性较好。
2.6 样品分析 应用所建立方法对56个贝类产品进行检测，均未检出虾夷扇贝毒素（YTX）。
3 结论
通过QuEChERS技术结合液相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱，能够有效净化贝类样品基质中的各种杂质，快速测定贝类产品中虾夷扇贝毒素。该方法快速简单、灵敏度高、 线性良好，回收率、精密度均能满足贝类产品中虾夷扇贝毒素限量要求。
参考文献 [1] 宋珊珊，车如心，刘仁沿，等.我国虾夷扇贝毒素的研究进展[J].海洋环境科学，2018，37（5）：785-791.
[2] 梁玉波，李冬梅，姚敬元，等.中国近海藻毒素及有毒微藻产毒原因种调查研究进展[J].海洋与湖沼，2019，50（3）：511-524.
[3] 阮雯， 纪炜炜， 岳冬冬，等.贝类生物毒素研究进展[J].渔业信息与战略，2017，32（4）：276-280.
[4] 谭志军，吴海燕，郭萌萌，等.脂溶性贝类毒素安全评价与检测技术研究进展[J].中国水产科学，2013，20（2）：467-479.
[5] 方丽媛，李代宗，肖勤.贝类毒素及其检测方法研究进展[J].中国渔业质量与标准， 2017，7（1）：41-49.
[6] 陈颖，白欣，宋月.超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱法测定贝类中的9种脂溶性贝类毒素[J].中国卫生检验杂志，2019，29（1）：22-25.
[7] 冯静，王超，华正罡.超高效液相色谱–串联质谱法测定贝类中8种脂溶性贝类毒素[J].化学分析计量，2019，28（S1）：23-27.
[8] 杨霄，黄华伟，伍远安，等.石墨烯-管尖固相萃取-液相色谱-串联质谱法测定贝类中10种脂溶性贝类毒素[J].色谱，2019，37（5）：505-511.
[9] 方科益，陈树兵，李双，等.水产品中11种海洋生物毒素的高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱检测方法研究[J].分析测试学报，2019，38（9）：1091-1096.
[10] 曾广丰，刘青，王志元，等.QuEChERS法结合高效液相色谱-高分辨飞行时间质谱测定食用贝类产品中4种脂溶性贝类毒素[J].食品工业科技，2015，36（21）：289-294.
[11] 陈剑刚，朱炳辉，梁素丹，等.固相萃取-液相色谱-串联质谱法测定贝类中的脂溶性贝类毒素[J].中国食品卫生杂志，2015，27（6）：624-629.
[12] 于慧娟，蔡友琼，黄宣运，等.10种麻痹性贝类毒素的固相萃取及液相色谱-串联质谱测定法[J].海洋渔业，2015，37（4）：364-371.
[13] 吴海燕，郭萌萌，赵春霞，等.液相色谱-串联质谱法筛查原多甲藻酸毒素及其代谢产物[J].色谱，2016，34（4）：401-406.
[14] 崔晗，刘玥婷，沈葆真，等.貝类产品中脂溶性贝类毒素检测方法的研究进展[J].食品安全导刊，2017（36）：146-147.
[15] 刘青，曾广丰，王志元，等.QuEChERS净化技术结合高效液相色谱-串联质谱法测定食用贝类产品中4种脂溶性贝类毒素[J].现代食品科技，2015，31（12）：338-344.
[16] 王婵，赵永拓，彭心婷，等.QuEChERS法联合高效液相色谱法快速检测扇贝中的软骨藻酸[J].食品安全质量检测学报，2015，6（1）：72-77.
转载注明来源:https://www.xzbu.com/1/view-15202841.htm
