一种功能性酸奶的研制及其抗氧化活性

来源:用户上传      作者:

　　 摘要：以鼠曲草水提物（GAE）和鲜牛奶为主要原料，与保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的混合菌种共发酵来研制一种功能性酸奶，并研究其品质和抗氧化活性。以GAE添加量、蔗糖添加量、接种量、发酵时间为因素，采用单因素和正交试验设计，根据感官评价和酸度来确定最佳配方和工艺参数，并进一步通过昆明小鼠体内和体外试验来评价其抗氧化活性。结果表明，GAE酸奶的最佳工艺配方为1.0% GAE、5%蔗糖、4%接种量，在42 ℃条件下发酵4 h时酸奶的口感最佳;该酸奶具有显著的清除ABTS、DPPH以及超氧化物和羟基自由基的能力，显著提高昆明小鼠血清超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性，显著降低血清丙二醛含量。通过最佳工艺发酵而成的高品质GAE酸奶具有显著的抗氧化能力，以及在食品工业中用作一种新型功能性食品的潜能。
　　 关键词：功能性酸奶;鼠曲草水提物;共发酵;最佳工艺;抗氧化;昆明小鼠
　　 中图分类号： TS201.3;TS252.54  文献标志码： A
　　 文章编号：1002-1302（2020）14-0221-06
　　鼠曲草是菊科鼠曲草属2年生草本，别称鼠麹草、清明菜，是营养价值极高的一种野菜，广泛用于多种食品生产的原料。鼠曲草还用于治疗肿胀、腰痛、炎症，及呼吸道和心血管疾病[1-2]。鼠曲草多酚含量高，在清除自由基、抑制脂质氧化和保护细胞免受氧化损伤等方面显示了明显的抗氧化活性[3]。
　　酸奶是全球范围内普遍消耗的食品，富含蛋白质、脂肪酸、维生素和矿质元素等有益于人体健康的成分[4-5]。近10年来，虽然人们已经发现并应用了一些加工技术，如添加合成化合物来改善酸奶的感官品质和功能特性，但它们对人体的潜在毒性和对酸奶营养价值的负面影响正受到人们的担忧和考虑。因此，人们努力从自然来源寻找新型和安全的添加剂[6-9]。
　　在传统的生产工艺中，像蔬菜汁、水果颗粒之类添加剂是在发酵过程结束后加入酸奶中的。因此，这些植物成分不参与发酵。这意味着含有植物成分的商业酸奶实际上是酸奶和植物成分的混合物。最近，相关研究报道，植物成分有益于人类健康（如抗氧化、抗病毒、抗菌和益生效果）与这些植物活性成分在人的肠道内和微生物共同发酵的结果密切相关。这意味着在酸奶发酵过程中微生物的代谢作用增强了植物成分的生物活性[10-12]。此外，还有一些相关研究报道，某些蔬菜和水果被认为是益生菌，可以作为乳制品的功能成分，有效改善乳制品的口感和质地等感官特性[13-14]。利用共发酵技术来提高酸奶中添加的蔬菜及水果对人的健康功效就成为可能。本研究目的是制备一种与鼠曲草水提物共发酵的酸奶，并观察共发酵工艺对酸奶质量的影响，通过对该新型酸奶的体内外抗氧化能力的测定，为其在功能性食品工业中的潜在应用提供相关依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料与试剂
　　鼠曲草地上部分（叶和花）于2018年3月采自我国南京，由南京晓庄学院陈全战教授鉴定。样本（编号：2018-03-18）风干后保存在南京晓庄学院药食两用植物遗传与种质创新实验室。
　　所有生物试剂及抗氧化试剂盒（SOD，CAT，GSH-Px，MDA）均购于南京建成生物工程研究所;分析纯化学试剂及蔗糖和脱脂奶粉均为市售;保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混合菌种在南京晓庄学院食品科学学院微生物学实验室保存。
　　昆明小鼠购于南京青龙山实验动物中心，饲喂标准的啮齿动物颗粒饲料和水。所有动物均置于（25±2） ℃，光照12 h/黑暗12 h，相对湿度45%～55%。所有动物试验程序均经南京晓庄学院动物保护与使用委员会批准。
　　1.2 仪器与设备
　　SW-CJ-2F型超净工作台，苏州净化设备有限公司;DHG-9070AD台式電热恒温鼓风干燥箱，苏州江东精密仪器有限公司;日本HITACHI CR21N高速冷冻离心机;PHS-3C精密pH值计，上海仪电科学仪器股份有限公司;RE52CS-1旋转蒸发器，杭州大卫科教仪器有限公司。
　　1.3 试验方法
　　1.3.1 鼠曲草水提物（GAE）的制备
　　200 g鼠曲草风干（25 ℃，15 d）后研磨成粉末，过60目筛，取100 g过筛后直径小于25 mm的小颗粒粉与 2 000 mL 50%（体积分数）的甲醇混匀，并搅拌（25 ℃，24 h）。然后过滤，滤液用旋转蒸发仪浓缩（45 ℃），抽真空3次，以抽出多余的甲醇。再通过冷冻干燥得冻干粉8.3 g（得率8.3%），于4 ℃冰箱保藏。
　　1.3.2 功能性酸奶的工艺流程
　　 GAE+蔗糖
　　 ↓
　　脱脂牛奶杀菌→冷却→混合调配→接种→发酵→冷却后熟→GAE酸奶
　　将脱脂奶粉与纯净水按一定比例混合，使重组脱脂牛奶的蛋白质含量为4.2%，将牛奶置于95 ℃水浴加热15 min后冷却到42 ℃。然后，将GAE溶解于无菌水，用0.22 μm滤膜过滤后与蔗糖（2%～6%）按一定比例添加到牛奶中，使GAE的最终质量浓度分别达到0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%。然后，用磁力搅拌器将所有样品于42 ℃搅拌10 min，以帮助溶解和混匀。将纯种保加利亚乳酸杆菌和嗜热乳酸链球菌2种菌的等量混合菌液组成的发酵剂以3%～7%的接种量加入到以上混合培养基质中。所有牛奶样品在42 ℃条件下孵育发酵，直至pH值达到4.50。当pH值达到要求后，将酸奶样品冷却至4 ℃，停止发酵处理。所有酸奶样品置于4 ℃冰箱贮存1、7、14、21、28 d，其中最佳工艺酸奶及对照（未加GAE）用于pH值、酸度和抗氧化活性等的进一步分析。
　　1.4 感官评价
　　评分标准见表1。
　　1.5 不同因素对GAE酸奶感官品质的影响 　　1.5.1 GAE添加量对酸奶感官品质的影响
　　以100 mL脱脂牛奶为准，蔗糖添加量4%，接种量4%，42 ℃发酵4 h，在每100 mL鲜奶中分别添加鼠曲草0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%，按照“1.3.2”节的工艺流程制作鼠曲草酸奶，并根据酸奶的口感确定GAE的最佳添加量。
　　1.5.2 蔗糖的添加量对GAE酸奶感官品质的影响
　　以100 mL鲜奶为准， GAE添加量1.0%， 接种量4%，42 ℃发酵4 h，在每100 mL鲜奶中分别添加蔗糖2%、3%、4%、5%、6%，按照“1.3.2”节的工艺流程制作GAE酸奶，并根据酸奶的口感确定蔗糖的最佳添加量。
　　1.5.3 接种量对GAE酸奶感官品质的影响
　　以100 mL鲜奶为准，在GAE添加量1.0%、蔗糖添加量5%、42 ℃发酵4 h条件下，在每100 mL鲜奶中分别接种3%、4%、5%、6%、7%的混合菌种进行乳酸发酵，按照“1.3.2”节的工艺流程制作GAE酸奶，并根据酸奶的口感确定最佳接种量。
　　1.5.4 发酵时间对GAE酸奶感官品质的影响
　　以100 mL鲜奶为准，在GAE添加量1.0%、蔗糖添加量5%、接种量5%的条件下，分别在42 ℃发酵3、4、5、6、7 h，按照“1.3.2”节的工艺流程制作GAE酸奶，并根据酸奶的口感确定最佳发酵时间。
　　1.6 GAE酸奶pH值和滴定酸度的测定方法
　　pH值的测定使用pH计，滴定酸度的测定参照文献[15]的方法，分别取贮存1、7、14、21、28 d的最佳工艺发酵GAE酸奶样品各10 g于烧杯中，加入10 mL蒸馏水，振荡均匀后，滴入2～3滴酚酞指示剂，用0.1 mol/L的NaOH标准溶液滴定至pH值 8.3±0.01，样品的酸度表示为每100 g酸奶中乳酸的含量，按公式（1）计算，未加GAE的酸奶作为对照。
　　滴定酸度（g/100 g）=[SX（]C×Vm[SX）]×0.9。
　　式中：C表示NaOH的浓度（mol/L），V表示滴定所消耗的NaOH的体积（mL）;m表示样品质量（g）;0.9表示乳酸的换算系数。
　　1.7 GAE酸奶体外抗氧化活性测定
　　对自由基ABTS、DPPH、超氧化物及羟基的清除能力的测定参照文献[3]的方法。分别取贮存1、7、14、21、28 d的最佳工艺发酵GAE酸奶样品各5 g置于离心管中离心（1 500 g，15 min，4 ℃），上清液用于各种指标的检测。未加GAE的酸奶作为对照。
　　1.8 GAE酸奶体内抗氧化活性测定
　　1.8.1 试验设计
　　30只昆明小鼠[（20±2） g，雌性]适应环境7 d后随机分成3组（每组10只）：对照组、普通酸奶组、GAE酸奶组，分别灌胃0.9% NaCl溶液、未加GAE的普通酸奶和最佳发酵工艺GAE酸奶，每天灌胃1次，灌胃体积为10 mL/kg体质量，灌胃量10 g/kg体质量，连续灌胃30 d。
　　1.8.2 生化指标的测定
　　最后1次灌胃前12 h对所有小鼠进行禁食不禁水处理，灌胃后1 h摘眼球取血，并迅速断颈椎处死，血样离心（1 500 g，10 min，4 ℃）后收集上清液血清用于抗氧化指标的检测，检测方法根据试剂盒法。
　　2 结果与分析
　　2.1 不同因素对产品感官品质的影响
　　2.1.1 GAE添加量对产品感官品质的影响
　　从图1可以看出，GAE添加量会明显改善酸奶发酵的风味和组织状态，随着添加量的增加，酸奶的整体感官品质明显上升。当添加量达到1.0%时，酸奶色泽均匀一致，略带黄色，香甜可口，细腻厚实，无凝块或机械杂质。当添加量过高，达到1.2%时，由于发酵时间过长导致味道略偏酸，不够细腻。因此，GAE添加量为1.0%时最佳。
　　2.1.2 蔗糖添加量对产品感官品质的影响
　　从图2可以看出，蔗糖添加量明显影响酸奶的口感，当添加量小于4%时，酸奶的甜度不够，而且过酸;当添加量大于4%时，感官评分明显下降，而且酸奶的口感过于甜腻;只有添加量为4%时，酸奶的口感较好，酸甜适宜，感官评分最高。因此，蔗糖的最佳添加量为4%。
　　2.1.3 接种量对产品感官品质的影响
　　从图3可见，接种量过大或过小都会影响酸奶的品质，当接种量为5%时最佳。接种量过小则会出现凝乳时间长、酸味不足等现象;接种量过大则会出现乳酸菌生长过快、乳清析出较多、质地粗糙、口感差等现象。
　　2.1.4 发酵时间对产品感官品质的影响
　　从图4可以看出，发酵时间过长或过短都影响酸奶的感官品质。发酵时间小于4 h会导致凝乳松软，滋味较差;大于4 h有水分析出，口感偏酸。而发酵4 h的酸奶色泽均匀一致，香甜可口，细腻厚实。因此，发酵时间4 h的酸奶品质最佳，感官评分最高。
　　2.2 GAE酸奶的工藝优化
　　2.2.1 正交试验因素
　　在单因素试验的基础上，以
　　[FK（W10][TPCYS4.tif]
　　GAE添加量、蔗糖添加量、接种量、发酵时间为因素，设计4因素3水平的正交试验（表2），以感官评分为标准，确定最佳工艺参数。
　　2.2.2 GAE酸奶最佳工艺优化
　　从表3可以看出，正交试验结果表明，GAE酸奶最优组合为A2B2C2D2，与实际最优组合一致。
　　2.3 最佳工艺GAE酸奶pH值和滴定酸度
　　从表4可以看出，随着贮存时间的延长，酸奶的pH值逐渐下降，酸度逐渐上升，但在前14 d，pH值及酸度的变化都没有显著差异;贮存21 d时，pH值下降不显著，但酸度显著上升;当贮存到28 d时，pH值及酸度都发生了显著和极显著变化，这可能暗示该酸奶的有效期为14～20 d。整个贮存期间，最佳工艺GAE酸奶和对照之间的pH值及酸度都没有显著差异，表明GAE酸奶没有从酸度上改变口味及品质。 　　2.4 最佳工藝GAE酸奶抗氧化活性
　　氧化应激通常定义为细胞或个体水平上氧化剂和还原剂的不平衡状态。氧化应激对人体健康有害，可引起多种慢性疾病，如肌肉变性、心血管疾病和神经系统疾病[16]。虽然服用一些合成抗氧化剂可以有效地抑制氧化过程，但它们对人体具有潜在的毒副作用。因此，通过饮食来提高机体的抗氧化能力是目前对抗氧化应激合理可行的方法[17]。在本研究中，与GAE共发酵的酸奶具有显著的体外抗氧化能力，且与GAE浓度呈正相关。
　　 从表5可以看出，当GAE浓度达到0.6%时，自由基清除率与对照相比显著提高;当GAE浓度达到0.8%及以上时，其清除率更加显著。
　　 从表6可以看出，1.0% GAE酸奶在贮存 28 d 内对ABTS、DPPH、超氧化物及羟基自由基的清除率都显著高于对照，但与第一天相比，在贮存21 d以后，其对自由基的清除率显著下降，表明 1.0% GAE酸奶的最佳有效期为14～20 d，此结果与pH值和滴定酸度结果相一致。
　　 本研究还通过测定超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等试验动物血清主要抗氧化酶的活性，评价酸奶的体内抗氧化潜能，这些酶常被用作指示机体产生活性氧（ROS）的生物标志物。SOD是ROS清除途径中的第1个关键酶，CAT、APX、GPX是该途径的第2个重要酶或关键酶[18]。ROS的产生也是脂质过氧化的结果，丙二醛（MDA）的含量是脂质过氧化的重要指标。本研究中，与对照组相比，普通酸奶组小鼠血清中抗氧化酶活性没有发生显著变化。而添加量为1.0%的GAE酸奶显著提高小鼠血清中抗氧化酶的活性，显著降低MDA含量，从而减轻脂质过氧化反应（表7）。
　　3 结论
　　根据单因素试验和正交试验及理化指标综合考虑，最终确定鼠曲草水提物（GAE）功能性凝固型酸奶的最佳工艺条件为GAE添加量1.0%、蔗糖添加量5%、接种量4%、在42 ℃条件下发酵4 h，在此条件下制得的酸奶口感最佳，风味独特，且成本低廉，制备工艺简单易行，易被生产商和消费者接受。
　　pH值和滴定酸度结果与体外抗氧化活性结果表明，1.0% GAE酸奶有效期长，为14～20 d，且有效期内体外抗氧化活性及酸度等保持稳定。
　　 动物试验表明，1.0% GAE酸奶能显著提高动物体内抗氧化酶活性，抑制活性氧的产生和脂质过氧化反应。该酸奶的体内外抗氧化活性可作为一种新型功能性保健酸奶进一步开发。
　　参考文献：
　　[1]Huang D，Chen Y H，Chen W S，et al. Anti-inflammatory effects of the extract of Gnaphalium affine D. Don in vivo and in vitro[J]. Journal of Ethnopharmacology，2015，176：356-364.
　　[2]Xi Z X，Chen W S，Wu Z J，et al. Anti-complementary activity of flavonoids from Gnaphalium affine D. Don[J]. Food Chemistry，2012，130（1）：165-170.
　　[3]Zeng W C，Zhang W C，Zhang W H，et al. The antioxidant activity and active component of Gnaphalium affine extract[J]. Food and Chemical Toxicology，2013，58：311-317.
　　[4]Lourens-Hattingh A，Viljoen B C. Yogurt as probiotic carrier food[J]. International Dairy Journal，2001，11（1/2）：1-17.
　　[5]Fernandez M A，Picard-Deland ，Le-Barz M，et al. Section 2：fermented foods as a source of healthy constituents.fermented foods in health and disease prevention[M]. New York：Academic Press，2017.
　　[6]Carocho M，Barreiro M F，Morales P，et al. Adding molecules to food，pros and cons：a review on synthetic and natural food additives[J]. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety，2014，13（4）：377-399.
　　[7]Hadi H G，Eskandari M H，Mesbahi G，et al. Scientific and technical aspects of yogurt fortification：a review[J]. Food Science and Human Wellness，2015，4（1）：1-8.
　　[8]Hotchkiss J H，Brenda G W，Edmund Y L. Addition of carbon dioxide to dairy products to improve quality：a comprehensive review[J]. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety，2006，5（4）：158-168. 　　[9]Karnopp A R，Oliveira K G，de Andrade E F，et al. Optimization of an organic yogurt based on sensorial，nutritional，and functional perspectives[J]. Food Chemistry，2017，233（15）：401-411.
　　[10]Al-Sheraji H S，Ismail A，Mohd Y M，et al. Prebiotics as functional foods：a review[J]. Journal of Functional Foods，2013，5（4）：1542-1553.
　　[11]Granato D，Nunes D S，Francisco J B. An integrated strategy between food chemistry，biology，nutrition，pharmacology，and statistics in the development of functional foods：a proposal[J]. Trends in Food Science & Technology，2017，62：13-22.
　　[12]Kumar H，Salminen S，Verhagen H，et al. Novel probiotics and prebiotics：road to the market[J]. Current Opinion in Biotechnology，2015，32：99-103.
　　[13]Saura-Calixto F，Pérez-Jiménez J，Tourio S，et al. Proanthocyanidin metabolites associated with dietary fibre from in vitro colonic fermentation and proanthocyanidin metabolites in human plasma[J]. Molecular Nutrition & Food Research，2010，54（7）：939-946.
　　[14]Ashley L S，Christophi G P，Gerard E K，et al. The microbial metabolite desaminotyrosine protects from influenza through type I interferon[J]. Science，2017，357（6350）：498-502.
　　[15]Pelaes-Vital A C，Goto P A，Hanai L N，et al. Microbiological，functional and rheological properties of low fat yogurt supplemented with Pleurotus ostreatus aqueous extract[J]. LWT - Food Science and Technology，2015，64（2）：1028-1035.
　　[16]Siti H N，Kamisah Y，Kamsiah J. The role of oxidative stress，antioxidants and vascular inflammation in cardiovascular disease （a review）[J]. Vascular Pharmacology，2015，71：40-56.
　　[17]Bjrklund G，Chirumbolo S. Role of oxidative stress and antioxidants in daily nutrition and human health[J]. Nutrition，2017，33：311-321.
　　[18]Davletova S，Rizhsky L，Liang H，et al. Cytosolic ascorbate peroxidase 1 is a central component of the reactive oxygen gene network of Arabidopsis[J]. The Plant Cell，2005，17（1）：268-281.
　　收稿日期：2019-07-07
　　基金項目：南京市重点学科项目（编号：NJZDXK201407）。
　　作者简介：陈玉胜（1968—），男，江苏盐城人，博士，高级实验师，主要从事营养学及药理学研究。E-mail：cys8691@163.com。
转载注明来源:https://www.xzbu.com/1/view-15301478.htm