免疫组化在肺小结节穿刺活检标本中对非小细胞肺癌诊断应用分析
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[摘要] 目的 探討CT引导下肺周围性小结节病变穿刺活检标本的免疫组化检测在非小细胞肺癌（NSCLC）鉴别诊断中的应用价值。 方法 方便收集该院2015年3月—2017年10月95例肺小结节穿刺活检所得组织学及细胞学标本，肿物平均直径3.0 cm，病理明确诊断非小细胞肺癌（NSCLC），采用免疫组化法对其结果进行回顾性分析，以充分了解TTF-1、NapsinA、P63、CK5/6、CK7表达情况，探讨其在非小细胞肺癌鉴别诊断中的应用价值，采用SPSS 19.0统计学软件进行统计学分析，计数资料采用率（%）进行统计学描述，检测技术计数资料之间比较采用χ2检验，以 P<0.05为差异有统计学意义。结果 95例临床经皮肺穿刺活检标本中，60例肺腺癌患者，TTF-1、NapsinA、CK-7蛋白表达的阳性率依次为93.3%、95.0%、98.3%；明显高于肺鳞癌的2.8%、5.7%、37.1%；组间差异有统计学意义（χ2=75.4，74.88，45.11，P<0.01）；35例肺鳞癌患者，P63、CK5/6蛋白表达的阳性率依次为91.4%、97.3%；明显高于肺腺癌的6.7%、8.3%，组间差异有统计学意义（χ2=67.48，72.05，P<0.01）。结论 CT引导下肺周围性小结节病变穿刺活检与手术切除活检相比，患者痛苦小，并发症少，对肺组织结构的破坏不明显，病理常规组织诊断学与免疫组织化学相结合，观察TTF-1、NapsinA、P63、CK5/6、CK7蛋白表达情况，为肺非小细胞肺癌鉴别诊断学提供了科学的诊断依据，对肺部周围性小结节诊断具有重的临床应用价值。
[关键词] CT引导；穿刺活检；非小细胞肺癌；免疫组化检测；鉴别诊断
[中图分类号] R734.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2019）03（b）-0029-04
[Abstract] Objective To investigate the value of immunohistochemical detection of CT-guided small pulmonary nodules in biopsy specimens for differential diagnosis of non-small cell lung cancer （NSCLC）. Methods Convenient collection of our hospital from March 2015 to October 2017 Histological and cytological specimens from 95 small pulmonary nodules biopsy， the average diameter of the tumor was 3.0 cm. The pathological diagnosis of non-small cell lung cancer （NSCLC） was performed. The results were retrospectively analyzed by immunohistochemistry. Fully understand the expression of TTF-1， NapsinA， P63， CK5/6， CK7， and explore its application value in the differential diagnosis of non-small cell lung cancer. Statistical analysis was performed using SPSS 19.0 statisticanl software， and the statistical data rate （%） was used for statistics. The description of the test and the comparison of the test technique count data were performed using the χ2 test， and the difference was statistically significant at P<0.05. Results In 95 cases of clinical percutaneous lung biopsy specimens， the positive rates of TTF-1， NapsinA， and CK-7 protein expression were 93.3%， 95.0%， and 98.3%， respectively， in 60 patients with lung adenocarcinoma； 2.8%， 5.7%， and 37.1% lung squamous cell carcinoma； the difference between the groups was statistically significant （χ2=75.4， 74.88， 45.11， P<0.01）； the positive rate of P63 and CK5/6 protein expression in 35 patients with lung squamous cell carcinoma order was 91.4% and 97.3%， which was significantly higher than 6.7% and 8.3% of lung adenocarcinoma. The difference between the groups was statistically significant （χ2=67.48， 72.05， P<0.01）. Conclusion Compared with surgical biopsy， CT-guided small pulmonary nodule lesion biopsy has less pain， fewer complications， and less damage to lung tissue structure. Pathological routine tissue diagnosis combined with immunohistochemistry. The expression of TTF-1， NapsinA， P63， CK5/6 and CK7 protein was observed， which provided a scientific basis for the differential diagnosis of lung non-small cell lung cancer. It has a clinical application value for the diagnosis of pulmonary small nodules. [Key words] CT guidance； Needle biopsy； Non-small cell lung cancer； Immunohistochemistry； Differential diagnosis
肺癌在肺部恶性肿瘤中最为常见，也是导致患者死亡率较高的疾病[1]，其中非小细胞肺癌占全部肺癌的80%，5年总生存率仅为5%～15%[2]。对于首诊明确诊断为肺癌的患者，其中约有66.67%处于肺癌晚期，但大部分患者只能获取到细针穿刺亦或是活检小标本，由于穿刺活检获取组织量少，致使30%～50%非小细胞肺癌组织学不能明确分型[3]。该文主要探讨该院2015年3月—2017年10月95例CT引导下经皮穿刺肺周围小结节活检所得组织学标本95例，其中腺癌60例，鳞癌35例，运用病理常规组织诊断学与免疫组织化学相结合在非小细胞肺癌（NSCLC）鉴别诊断中的临床应用价值，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 一般材料
方便收集该院95例肺小结节穿刺活检所得组织学标本，肿物平均直径3.0 cm，病理明确诊断为非小细胞肺癌（NSCLC），其中腺癌60例，鳞癌35例，采用免疫组化法对其结果进行回顾性分析，所用抗体根据病理常规组织形态观察选用，包括TTF-1、NapsinA、CK7、P63、CK5/6。
1.2 方法
①定位、穿刺：扫描前嘱咐患者进行呼气/屏气练习。依照病变位置确定患者采用侧卧位、俯卧位或是仰卧位。低剂量螺旋CT扫描选择相应穿刺层面，确定穿刺深度，角度，并行体表定位，确定穿刺点后，做标记于皮肤上。常规消毒、铺巾，根据之前设定方向、角度在局部麻醉下刺入活检针于胸壁，再次进行CT扫描，确定厚度为2 mm， 确认穿刺针的针尖位于病灶内或病灶边缘，按活检枪，扣动扳机，迅速退针取材。采用同样方法，变换穿刺针向病灶内不同方向取材2～3次。穿刺结束令患者再次屏住呼吸快速退针，常规消毒，包扎进针点，CT扫描、复查，观察有无出血、气胸等并发症，嘱病人减少活动，卧床休息24 h，避免剧烈咳嗽。
②病理标本制备：穿刺活检所取组织条大小约0.1 cm×0.1 cm×2.0 cm 2～3条，将其分别推至一滤纸片上，10%中性甲醛固定，常规脱水、浸蜡、包埋，切片厚3～5 μm，HE染色，显微镜下观察。
③免疫组织化学染色法：标本石蜡包埋，3～5 μm连续切片，37°烤片过夜。二甲苯脱蜡，70%、75%、80%、85%、95%、无水，梯度乙醇脱水，3%过氧化氢孵育处理10 min，水洗，放入枸橼酸缓冲液（10 mmol/L，pH 6.0）内，用微波仪170 W辐射5 min，进行抗原修复，冷却后磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤1 min×3次，加入山羊抗血清封闭，微波仪130 W辐射5 min，保温2 min，甩去血清，滴加需检测的标记TTF-1、NapsinA、CK7、P63、CK5/6微波仪130W辐射5 min，PBS洗涤2 min×3次，加入二抗，微波仪130W辐射5 min，PBS洗涤2 min×3次， H2O2-DAB显色5～10 min，PBS洗，自来水冲洗，Haarris苏木素染核5～10 min，水洗、盐酸酒精分化、组织蓝化、最后进行脱水、透明并封固。试剂盒购自迈新生物技术公司（均为即用型），采用微波-链霉素-生物盐缓冲液代替一抗作为阴性对照。
1.3 结果判读
P63和TTF-1主要在细胞核表达，CK5/6主要在细胞膜以及在细胞质中表达，Napsin A、CK7主要在细胞质中表达。根据细胞阳性数目和着色强度进行结果判读，具体方法如下：0分，着色强度提示无色；1分，浅黄色或是黄色；2分，棕黄色。0分，提示阳性细胞数<10%；1分，10%～50%；2分，>50%。上述两项结果分数≤2分，即为阴性；≥2分，即为阳性[4-9]。
1.4 统计方法
采用SPSS 19.0统计学软件进行分析，计数资料采用率（%）进行统计学描述，检测技术计数资料之间比较采用χ2检验， P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 免疫组化表达结果
95例肺小结节穿刺活检所得组织学及细胞学标本，其中60例腺癌患者 ，TTF-1 、NapsinA 、CK-7 蛋白表达的阳性率依次为93.3%、95.0%、98.3%，明显高于肺鳞癌的2.8%、5.7%、37.1%，组间差异有统计学意义（P<0.01）；30例鳞癌患者 ，P63 、CK5/6 蛋白表达的阳性率依次为91.4%、97.0%，明显高于肺腺癌的6.7%、8.3%，组间差异有统计学意义（P<0.01），見表1。
2.2 病理常规组织诊断学与免疫组织化学相结合结果
病理常规组织诊断学与免疫组织化学相结合一致性病例69例，其中腺癌40例，鳞癌29例。病理常规组织诊断学分型准确率为73%；95例肺癌标本中综合形态学及免疫组化进一步分型标本23例，其中腺癌15例，鳞癌5例，病理常规组织诊断学与免疫组织化学相结合分型准确率为96.8%；病理常规组织诊断学与免疫组织化学诊断不一致病例3例，其中1例鳞癌诊断为腺癌（图1、图2、图3、图4），2例腺癌诊断为鳞癌（图5、图6、图7）。
2.3 特异性以及敏感性评价
肺小结节穿刺所得组织学及细胞学标本免疫组化检测中，TTF-1、NapsinA、CK-7阳性表达对腺癌进行诊断的敏感性依次为95%、96.67%、98.3%，特异性依次为97.14%、94.28%、62.8%。而P63与CK5/6对鳞癌进行诊断敏感性依次为94.28%、97.14%，特异性依次为95%、91.67%。
3 讨论
CT引导下经皮肺穿刺活检自Haaga于1976年首次在临床中应用以来，目前该技术已成为诊断肺周围性结节或包块的重要技术手段[9]，具有方便、快速、对病患损伤小，无严重并发症，是一项成熟的活检技术，采用CT引导可多点定位、多点取材，对于肺内周围性及多发小结节病灶的诊断，穿刺的优越性就再加显著。 非小细胞肺癌（NSCLC）占所有肺癌类型的80%，组织学类型主要包括腺癌（≥40%）和鳞癌（30%），以及较为少见的大细胞癌（LCC）（10%）。随着肺腺癌和鳞癌个体化治疗方案的日趋不同，临床强烈要求对不同组织学类型的NSCLC明确诊断[7]。对于首诊明确的肺癌的患者，当中约有66.67%处于肺癌晚期，大部分患者只能获取到细针穿刺或是活检小标本[2]，肺癌主要为高分化腺癌或鳞癌，多数根据组织形态学可以进行分类，但有一小部分却不能，尤其在小活检病例中组织分型就更为困难[1]，此时有效的免疫组化标志物在辅助诊断和鉴别诊断中便会尤显重要。
病理常规诊断学诊断腺癌的依据是癌组织具有腺样分化的特征，可呈腺泡状，贴壁样，乳头状。腺癌组织分化好者，腺样特征明显，分化差者，组织内可出现实性区，上述特征不明显[1]。TTF-1、NapsinA、CK7通常被认为是肺腺癌的标志物，甲状腺转录因子（TTF-1）是一种分子量为38～40 ku的核蛋白，其表达与分化程度和组织学类型有关，具有Ⅱ型肺泡上皮细胞/Calar细胞特征的腺癌几乎全部表达TTF-1，泌黏液性腺癌呈不同程度表达 。NapsinA是一种胃酶样天门冬氨酸蛋白酶，是肺癌的一种新标记物，其敏感度和特异性均高于TTF-1，文献报道其敏感性为73.8%～93.6%[2]。CK7即细胞角蛋白，几乎100%的肺腺癌均表达，其极高的敏感度使得CK7成为肺腺癌诊断和鉴别诊断最常用抗体之一，但特异性却较低，30%～60%肺鳞癌也不同程度表达CK7[7]。
肺鳞癌分三类，角化型鳞状细胞癌、非角化型鳞状细胞癌、基底细胞样鳞状细胞癌。角化型鳞状细胞癌其诊断依据为镜下找到角化、角化珠、细胞间桥等鳞癌分化特征形态学易于诊断，其诊断难点为基底细胞样鳞癌和小细胞癌和鉴别诊断，需行免疫组织化学进行判断。P63和CK5/6通常认为是鳞状细胞癌的免疫组化标记物[8]。P63是肺鳞癌常用的标记物，阳性定位于细胞核，在小活检标本中易于辨认，据文献统计，诊断肺鳞癌敏感性高达97.4%，但特异性较低，仅有72.8%。CK5/6是肺鳞癌最常用的免疫标记物，其表达与鳞癌的分级、分化无关，但也有研究显示，20%的低分化鳞癌不表达或是呈低表达[7]，在腺癌未见表达。
CT引导下经皮肺小结节穿刺活检与手术切除活检相比，患者痛苦小，并发症少，对肺组织结构的破坏不明显，其病理常规诊断学与免疫组织化学相结合在穿刺标本活检诊断与术后病理诊断一致性高，尤其是对恶性肿瘤的诊断[9-11]。该研究选取临床上95例肺小结节穿刺活检所得组织学标本，肿物平均直径3.0 cm，病理明确诊断非小细胞肺癌（NSCLC），采用免疫组化法对其结果进行回顾性分析，以充分了解TTF-1、NapsinA、P63、CK5/6、CK7表达情况，探讨其在非小细胞肺癌鉴别诊断中的应用价值。结果显示：95例临床标本中，60例肺腺癌患者，TTF-1、NapsinA、CK-7蛋白表达的阳性率依次为93.3%（56/60）、95.0%（57/60）、98.3%（59/60）；明显高于肺鳞癌的2.8%（1/35）、5.7%（2/35）、37.1%（13/35）；组间差异有统计学意义（P<0.01）；35例肺鳞癌患者，P63、CK5/6蛋白表达的阳性率依次为91.4%（32/35）、97.3%（33/35）；明显高于肺腺癌的6.7%（4/60）、8.3%（5/60），组间差异有统计学意义（P<0.01）；TTF-1、NapsinA、CK-7阳性表达对腺癌进行诊断的敏感性依次为95%、96.67%、98.3%，特异性依次为97.14%、94.28%、62.8%；而P63与CK5/6对鳞癌进行诊断敏感性依次为94.28%、97.14%，特异性依次为95%、91.67%。
综上所述，CT引导下经皮肺周围性小结节穿刺活检，具有定位准确，患者痛苦小、并发症少，可以取得一定的组织条标本，在无挤压下保持标本形态不变，便于病理组织形态学诊断。但由于穿刺所得标本量少，对于低分化肿瘤的诊断即使有经验的病理医生也难以做出判断，所以病理组织诊断学与免疫化学相结合，为肺非小细胞肺癌鉴别诊断学提供了科学的诊断依据，对肺部周围性小结节的诊断具有重要的临床价值，值得应用推广。
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（收稿日期：2018-12-20）
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