双氢青蒿素对低氧下人肺动脉内皮细胞增殖和分泌功能影响

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　　[摘要] 目的 探討双氢青蒿素（Dihydroartemisinin，DHA）对低氧条件下人肺动脉内皮细胞的数量和功能影响，寻找治疗低氧性肺动脉高压的新方法。 方法 将人肺动脉内皮细胞株进行复苏、传代、鉴定，然后细胞实验分为常氧组、低氧组、低氧+DHA干预组，造模48 h后，分别检测人肺动脉内皮细胞的增殖能力（CCK-8法）、ELISA法检测细胞上清液中超氧物歧化酶（SOD）活性和一氧化氮（NO）含量。 结果 常氧组、低氧组、低氧+DHA干预组的CCK-8法检测OD值分别为（0.813±0.012）、（0.905±0.018）、（0.842±0.015），各组间比较差异有统计学意义（P<0.05）;各组SOD活力检测分别为（40.665±0.865）U/mL、（12.988±0.556）U/mL、（26.376±0.831）U/mL， 各组间比较差异有统计学意义（P<0.05）;各组 NO含量分别为（23.803±0.778）μmol/L、（48.668±0.881）μmol/L、（37.497±0.793）μmol/L，各组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 DHA可以抑制低氧诱导下人肺动脉内皮细胞的增殖能力，改善低氧诱导下SOD活性和抑制低氧诱导下分泌NO的能力;提示DHA对低氧诱导的人肺动脉内皮细胞具有保护作用，推测其对低氧性肺动脉高压的形成可能具有拮抗作用。
　　[关键词] 双氢青蒿素;低氧;肺动脉内皮细胞;肺动脉高压
　　[中图分类号] R563.9          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2020）04-0015-04
　　Effects of dihydroartemisinin on proliferation and secretion of human pulmonary artery endothelial cells under hypoxia
　　YU Hua1   WANG Liangxing2   LIU Jingjing2   DONG Yizhi2   XIA Xiaoru3   GUAN Huaqin2
　　1.Department of Cadre Health， the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Hangzhou   325000，China;2.Department of Respiratory Medicine， the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Hangzhou   325000，China;3.Department of Rheumatology and Immunology， the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Hangzhou   325000，China
　　[Abstract] Objective To investigate the effects of dihydroartemisinin （DHA） on the number and function of human pulmonary artery endothelial cells under hypoxic conditions， and to find a new treatment for hypoxic pulmonary hypertension. Methods Human pulmonary artery endothelial cells were resuscitated， passaged and identified. Then the cells were divided into normoxia group， hypoxia group and hypoxia+DHA group. Human pulmonary artery endothelial cells were resuscitated， passaged and identified. Then the cells were divided into normoxia group， hypoxia group and hypoxia+DHA group. After 48 hours of modeling， the proliferation of human pulmonary artery endothelial cells was detected （CCK8 method）. The superoxide dismutase （SOD） activity and nitric oxide （NO） content in the cell supernatant were determined by ELISA method. Results The OD values of CCK-8 method in normoxia group， hypoxia group and hypoxia+DHA group were （0.813±0.012）， （0.905±0.018）， and （0.842±0.015）， respectively. The differences between the groups were statistically significant （P<0.05）. The SOD activity of each group was （40.665±0.865）U/mL， （12.988±0.556）U/mL， and （26.376±0.831）U/mL， and the differences were statistically significant （P<0.05）. The NO content of each group were （23.803±0.778）μmol/L， （48.668±0.881）μmol/L， and （37.497±0.793）μmol/L， and the differences were statistically significant among groups. Conclusion DHA can inhibit the proliferation of human pulmonary artery endothelial cells induced by hypoxia， improve the activity of SOD and inhibit the secretion of NO; suggesting that DHA has protective effect on hypoxia-induced human pulmonary artery endothelial cells， and it may have an antagonistic effect on the formation of hypoxic pulmonary hypertension. 　　[Key words] Dihydrol Artemisinin; Hypoxia; Human pulmonary artery endothelial cells; Pulmonary hypertension
　　低氧性肺动脉高压（Hypoxic pulmonary hypertension，HPH）是临床上肺动脉高压的一种常见类型，常继发于慢性阻塞性肺病、间质性肺病、混合型睡眠呼吸暂停综合征、长期高原暴露等。其主要病理生理机制是肺血管重塑[1]，其中缺氧时的肺动脉内皮细胞的病理生理改变及对药物的反应也逐渐成为研究热点。双氢青蒿素是一种抗疟药物，前期研究发现还具有抗炎、抗肿瘤、抗组织纤维化等作用[2-4]。研究报道，双氢青蒿素对野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压具有一定保护作用[5]，但低氧性肺动脉高压形成也是否具有保护作用未见报道。因此，本研究拟通过建立人肺动脉内皮细胞（Human pulmonary artery endothelial cells，HPAECs）的低氧模型，初步探索双氢青蒿素对低氧条件下人肺动脉内皮细胞的增殖能力、分泌超氧物歧化酶（SOD）和一氧化氮（NO）能力的影响，初步探讨双氢青蒿素对低氧性肺动脉高压的可能保护作用机制。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料来源
　　1.1.1 实验细胞株  人肺动脉内皮细胞（HPAECs）株购自美国Sciencell公司。
　　1.1.2 实验试剂  双氢青蒿素购自Sigma公司，CCK-8试剂盒购自上海同仁化学研究所，SOD、NO ELISA检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，Anti CD31抗体购自Cell Signaling Technology公司，胎牛血清、0.25%胰酶-EDTA、DPBS购自 Gibico公司），抗荧光猝灭封片剂、一抗稀释液、DAPI染色剂购自碧云天生物技术有限公司），内皮细胞生长添加物（ECGs）购自Stoughton Biomedical Technologies公司，內皮细胞专用培养基购自美国Sciencell公司， 多聚甲醛固定液、 100%Triton X-100细胞透化剂均购自北京索莱宝科技有限公司。
　　1.1.3 实验仪器  荧光倒置显微镜（日本Nikon C-HGFI），多功能酶标仪ELX800（美国 BioTek Instruments），CO2恒温细胞培养箱（美国Thermo Fisher Forma），三气培养箱（美国Thermo Fisher HERA cell），倒置相差显微镜（日本Olympus公司），恒温水浴箱（北京科伟永兴仪器有限公司），超净工作台（苏州净化设备公司），常温低速离心机（上海安亭科学仪器厂），震荡器（江苏海门市斯林贝尔仪器制造有限公司），微量移液器（德国 Eppendorf 公司），培养瓶/培养板（美国Corning公司），15 mL/50 mL NEST离心管（中国江苏省无锡市耐思生物科技有限公司），盖玻片（中国江苏省海门昌隆仪器有限公司），载玻片（中国江苏省海门昌隆仪器有限公司），液氮罐（中国成都YDS.10型）。
　　1.2 方法
　　1.2.1 HPAECs细胞株复苏、传代培养  取1管冻存的细胞株，迅速置入37℃恒温水浴箱1～2 min，待融化完全后，移入15 mL离心管，1000 r/min离心5 min，弃上清，加入含15%胎牛血清的内皮细胞专用培养基（含ECGs），重悬后接种在25 mL培养瓶中，置入37℃含21%O2、5%CO2标准培养箱中，待细胞密度达到80%～90%时，取出，弃培养基，加入0.25%胰酶-EDTA 1 mL进行消化，1000 r/min离心5 min，弃上清液，然后用含15%胎牛血清的内皮细胞专用培养基重悬后传代培养。
　　1.2.2 HPAECs的鉴定  取传至第3代的细胞，将细胞接种在在盖玻片上生长融合到95%～100%时，从培养箱中取出，用DPBS洗3次后，4%的多聚甲醛固定，1%Triton X-100透化，DPBS洗3次，再加入一抗CD31稀释液（1：200），4℃过夜后，DPBS洗3次，加入二抗稀释液（1：200）闭光30 min，再DPBS洗3次，最后用DAPI进行细胞核染色10 min，DPBS洗3次后，将盖玻片加到载玻片上，用抗荧光淬灭液封片，荧光显微镜下观察并拍照。
　　1.2.3 低氧造模、实验分组  低氧造模条件是将三气培养箱参数设置为（37℃、1%O2、5%CO2、94%N2），培养48 h，常氧组仍放在标准培养箱中，参数设置为（37℃、21%O2、5%CO2），培养48 h。设立常氧对照组（21%O2， 48 h）、低氧诱导（1%O2，48 h）组、低氧（1%O2，48 h）+DHA干预组共3组;每组设3个复孔;其中DHA干预方式为将配好的标准母液直接加入6孔板中，经 CCK-8法检测细胞毒性实验，以60 μmol/L 为DHA的最佳干预浓度。
　　1.2.4 CCK-8法检测各组HPAECs的增殖能力  各组细胞造模48 h后，加入0.25%胰酶-EDTA 1 mL将各组细胞消化下来，1000 r/min离心5 min，弃上清液，用含15%胎牛血清的内皮细胞专用培养基重新制成单细胞悬液并计数，按每孔5000个/100 μL细胞接种密度接种到96孔板上，按照CCK-8试剂盒检测步骤，每孔再加入CCK-8检测试剂10 μL，继续放置细胞培养箱培养2 h后，取出，避光条件下在酶标仪上450 nm处测吸光度OD值。
　　1.2.5 各组细胞上清液中的SOD活力检测  各组细胞造模48 h后，小心提取各组细胞上清液0.1 mL，按SOD活力检测试剂盒步骤，按先后顺序与试剂盒中检测试剂一、试剂二、试剂三、试剂四混合，旋涡振荡充分混匀60 s后，置37℃恒温水浴箱准确40 min，再加入2 mL显色剂混匀，室温放置10 min后，在酶标仪上550 nm处测吸光度OD值，然后根据试剂盒中提供的公式计算SOD活力（U/mL）。 　　1.2.6 各组细胞上清液中的NO检测（硝酸还原酶法）  各组细胞造模48 h后，小心提取各组细胞上清液0.1 mL，按NO检测试剂盒步骤，按先后顺序与试剂盒中检测试剂一和试剂二混合，旋涡振荡充分混合后，置37℃恒温水浴准确60 min，再按先后顺序加入试剂三和试剂四混合，旋涡振荡充分混合30 s后，在室温下静置10 min，上离心机（3500～4000）转/min，离心10 min，提取上清液0.5 mL，加入0.6 mL 显色剂混匀，在室温下放置10 min后，在酶标仪上550 nm处测吸光度OD值，然后根据试剂盒中提供的公式计算NO含量（μmol/L）。
　　1.3 观察指标
　　所培养的细胞经CD31免疫荧光染色发绿色荧光为内皮细胞;所有各组细胞造模48 h后结束，按实验内容要求收集细胞或上清液，分别测定各组HPAECs的增殖能力、细胞上清液中的SOD活力、细胞上清液中的NO含量，然后根据所获得的数据进行统计学处理分析。
　　1.4 统计学处理
　　采用SPSS 22.0统计学软件进行统计分析，计量资料均以均数±标准差（x±s）表示，方差齐性检验后两两比较采用成组设计t检验，多组间比较采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 细胞培养鉴定的图片
　　细胞株解冻复苏、培养，经CD31免疫荧光染色发绿色荧光，鉴定为内皮细胞，CD31是内皮细胞特有的分化标志，见封三图3，选用3～4代生长良好的HPAECs进行后续实验。
　　2.2 各组细胞增殖能力（OD值）、细胞上清液中的SOD活力、NO含量检测结果比较
　　与常氧组相比，低氧组的细胞增殖能力明显增加，而低氧+DHA干预组增殖能力较低氧组减少，差异均有统计学意义（P<0.05）;低氧组细胞上清液中的SOD活力较常氧组明显下降，而低氧+DHA干预组的SOD活力较低氧组有明显上升，差异均有统计学意义（P<0.05）;低氧组细胞上清液中NO含量较常氧组明显升高，而低氧+DHA干预组的NO含量较低氧组有明显下降，差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。
　　3 讨论
　　肺动脉高压是近年医学研究的一个热点，其主要病理生理特点为肺动脉压力升高及肺血管阻力增加，以肺血管增殖和肺血管重塑为主要特征。肺血管重塑是指肺血管结构细胞（如内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞等）出现异常增殖，分泌功能活跃，伴随细胞外间质（如胶原、弹力蛋白、纤维结合素和黏胶素）的异常聚集，滋养血管的增生等，引起肺血管内膜和（或）中膜增厚，导致血管壁增厚，管腔狭窄，引发肺动脉高压。近年来发现在多种致病因素作用下，如低氧诱导下可引起血管内皮细胞损伤，血管内皮合成和分泌的各种血管舒张因子平衡失调导致早期的肺血管收缩及后期的肺血管重塑，从而参与肺动脉高压的发生发展。
　　内皮细胞是肺血管内膜主要的结构细胞，通过增殖、迁移和表型分化在肺血管重塑中起着十分重要的作用。缺氧刺激可以通过损害肺动脉血管内皮，引起内皮细胞功能紊乱，进而引起肺血管收缩和促进肺动脉内皮细胞增殖及分泌功能紊乱，促进肺动脉血管重塑，引起肺动脉高压[6]。内皮细胞自身增殖导致血管内膜增厚在肺血管重塑中作用有限，而由于内皮细胞分泌功能紊乱，进而刺激其他血管结构细胞异常增殖和细胞外间质的聚集，会继续加重肺血管的重塑，引起肺动脉高压。本研究发现，低氧组的HPAECs增殖能力比常氧组明显增高，而且由于氧化应激的作用，低氧组的SOD活性较常氧组下降，NO分泌能力比常氧组明显升高。SOD 是生物体内非常重要的抗氧化酶，通过与O2-反应形成过氧化氢，参与清除氧自由基从而保护细胞免受氧化性损害，SOD的活性高低直接反映了机体清除自由基，抗氧化能力的强弱[7]。NO是内皮细胞分泌的主要血管舒张因子之一，其适量表达可以舒张血管、抑制平滑肌细胞增殖，减轻氧化应激带来的损伤;但NO表达过量时，可快速与游离的活性氧产生反应，生成过氧化亚硝酸盐，加重氧化应激带来的细胞损伤，从而促进肺血管重塑，引起肺动脉高压[8]。
　　雙氢青蒿素（DHA）是青蒿素在体内的主要代谢物，与青蒿素比较，双氢青蒿素具有水溶性好、生物利用度高、毒性较小、效力强、抗疟作用明显的特点，而且对肿瘤细胞具有显著的抑制作用，是近年来具有良好的开发前景的药物之一，也是当今医学研究热点药物[9]。多项研究发现其还具有抗炎、调节免疫、抑制内皮细胞增殖、促进血管平滑肌细胞的凋亡、抗肺纤维化等作用[10-15]，由此推测其可能还具有逆转肺动脉高压作用。有学者研究发现DHA灌胃治疗可直接降低野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压，其可能机制是通过阻止促炎细胞因子及炎症介质的释放降低血清白介素-6和C反应蛋白水平，减轻肺血管炎症反应从而延缓肺动脉高压病程的发展[5]，但对于低氧性肺动脉高压发生发展的影响尚未见报道。本研究通过离体细胞水平发现，DHA可以抑制低氧诱导刺激的HPAECs的增殖，同时可以提高低氧状态下的SOD活性，并部分抑制NO的分泌，从而减轻低氧刺激对内皮细胞的损伤及对肺血管重塑的影响，因此推测其对低氧性肺动脉高压的形成具有保护作用，其可能机制为通过调节TGF-β/smad和mTOR途径，从而减轻低氧对内皮细胞的炎症反应，而mTOR途径已被多个实验证实与自噬相关[16-23]，因此DHA是否通过自噬途径实现这种保护作用有待研究进一步证实。
　　综上所述，DHA对低氧下肺动脉内皮细胞具有保护作用，其通过何种机制途径有待于进一步研究证实。由于DHA具有低毒、性价比高等特点，后续可能成为一种治疗低氧性肺动脉高压的安全有效、经济实惠的药物。
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　　（收稿日期：2019-03-22）
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