抗肝纤维化佤族用药筛选研究
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作者:梁志庆 倪凯 李文琦
摘要：目的 研究佤族肝病用药针对肝星状细胞HSC-T6增值和活力的影响从而筛选出有效的抗肝纤维化药物。方法 采用Celigo Cytomter全视野细胞扫描分析仪，直接对健康生长条件下空白组及分别以不同浓度给予等量不同药的给药组肝星状细胞进行分析，通过对细胞增值和活力的观察分析，筛选出具有显著抑制肝星状细胞增值的药材。结果 给药组肝星状细胞HSC-T6的细胞数目少于空白组肝星状细胞HSC-T6的细胞数目。结论 佤族肝病用药对肝星状细胞有一定的抑制作用。
关键词：佤药;肝纤维化;肝星状细胞;筛选
中图分类号：R29 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2020）02-0087-03
肝纤维化（Hepatic fibrosis，HF）是各种慢性肝病发展为肝硬化的共同病理过程和发展途径，是肝脏对各种损伤所产生的一种修复反应，其主要特征表现为肝星状细胞（Hepatic stellate cells，HSC）的大量增殖和细胞外基质（extracellular matrix，ECM）在肝脏内过度沉积特別是胶原的过度合成。在肝纤维化的早期，肝星状细胞由“静止”转变为“活化”的肌成纤维细胞（myofibroblast，MFB），随后活化的肝星状细胞过度增殖并大量合成各种细胞外基质成分[1-2]。肝星状细胞（HSC）是肝纤维化的细胞学基础，是肝纤维化的效应细胞，也是细胞外基质的主要产生细胞，其活化是肝纤维化形成的开端[3-4]。因此，临床主要通过抑制HSC活化和促进HSC凋亡来逆转肝纤维化的进程。在前期调研过程中，课题组发现佤族药治疗肝病具有本民族的特色和优势，近些年已在单味中药、单验方等方面取得了一定的进展。在佤族地区，民间佤医非常注重鲜品药物（以植物药为主）的使用，在使用鲜品药物中常用的剂型有汤剂、饮剂、外包剂、外搽剂、外洗剂等。肝炎则多用日不给杏、努公把、日不润卜歪、日不安里。德娘百艾（均为佤名）等[5-7]。
课题组在实验过程中正是选择了20余种佤族治疗肝病的习用药材，进一步在肝星状细胞HSC-T6上进行验证分析，通过Celigo Cytomter全视野细胞扫描分析仪对健康生长条件下的肝星状细胞以及给药之后的不同时间段的肝星状细胞状态进行观察分析总结，得出最后结论。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验细胞 肝星状细胞HSC-T6细胞株购自于中国科学院昆明动物研究所细胞库（编号：KCB200703YJ）。
1.2 实验药物与试剂 实验用佤药共26种，随机数字编号为1到26号，批号：20190505，均购自于沧源县中医佤医医院;中美特级胎牛血清（1829596）、DMEM/高糖培养液（0010219）、青霉素-链霉素溶液（1843964）、胰蛋白酶溶液（00034618）上述试剂均购自云南泽浩商贸有限公司。
1.3 实验仪器 Celigo Cytomter全视野细胞扫描分析仪，美国Nexcelom，耐细隆生物仪器（上海）有限公司;真空操作台，AIRTECH;OLYMPUS BX600显微镜，奥林巴斯（北京）销售服务有限公司;CO2细胞培养箱，美国SHELLAB;DLAB离心机，型号：DM0412，大龙兴创实验仪器（北京）有限公司;超纯水系统，英国ELGA Classic UF;-80℃超低温冰箱，Ermo Fisher;TGL16M冷冻高速离心机 Eppendow。
1.4 药材前处理 随机抽选编号5，8，10，23，24共5种药材每种各100g，按1：10的比例加水，煎煮30分钟，滤出药液。取药渣再按上述方法提取两次，合并三次滤液，浓缩滤液至20ml，放于-20℃冰箱保存备用。最后药物浓度为1 g/mL的原液，在80℃水浴30分钟、连续3天高温灭活后，1000 rpm离心10分钟，-20℃冻存备用。实验时临用时用DMEM培养基溶解药物为20 mmol/L母液浓度后，倍比稀释至3 个浓度（200、400、800 μg/mL）三组备用。
1.5 受试药材对HSC-T6细胞增殖和细胞活力的影响 将HSC-T6细胞消化传代，取对数生长期的HSC-T6细胞，将每组细胞以1×104个/孔接种于96孔板中。然后放入37℃、5%CO2细胞培养箱内培养，24 h后分别加入等量受试药材，每种药材分别设3个浓度组（200、400、800 μg/mL），用培养基稀释至相应浓度，每组设4个复孔，空白组加入等量培养基，分别在药材刺激后24 h，48 h，72 h取出96孔板，用Celigo Cytomter全视野细胞扫描分析仪检测细胞增值和细胞活力情况，从而评价药物对HSC-T6细胞生长的影响，筛选出对其增殖具有显著抑制作用的药材。
1.5 统计学方法 实验结果用SPSS25.0软件进行统计，各组均数之间的比较采用单因素方差分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，符合正态分布、方差齐用方差分析，方差不齐用非参数检验，P>0.05为差异无显著性意义，P<0.01为差异有非常显著性意义，P<0.05为差异有显著性意义。
2 结果
2.1 不同浓度的5号佤药对平均细胞数的影响 从实验结果看，佤药A中、高浓度对肝星状细胞数有影响，两组肝星状细胞数呈缓慢增长趋势，与空白组比较，中浓度组在48～72 h时，P<0.05为差异有显著性意义，高浓度组在0～72 h时，P<0.01为差异有非常显著性意义，低剂量组差异无统计学意义。见表1。
2.2 不同浓度的8号佤药对平均细胞数的影响 从实验结果看，佤药B中、高浓度对肝星状细胞数有影响，两组肝星状细胞数呈缓慢增长趋势，与空白组比较，高中浓度组在0～72 h时，P<0.01为差异有非常显著性意义，低剂量组差异无统计学意义。见表2。 2.3 不同浓度的10号佤药对平均细胞数的影响 从实验结果看，佤药C各剂量浓度对肝星状细胞数均无有影响，肝星状细胞数呈增长趋势，与空白组比较，各剂量组差异无统计学意义。见表3。
2.4 不同浓度的佤药23号对平均细胞数的影响 从实验结果看，佤药D中、高浓度对肝星状细胞数有影响，两组肝星状细胞数呈缓慢增长趋势，与空白组比较，中浓度组在48～72 h时，P<0.05为差异有显著性意义，高浓度组在0～72 h时，P<0.01为差异有非常显著性意义，低剂量组差异无统计学意义。见表4。
2.5 不同浓度的佤药24号对平均细胞数的影响 从实验结果看，佤药E中、高浓度对肝星状细胞数有影响，两组肝星状细胞数呈缓慢增长趋势，与空白组比较，中浓度组在48～72 h时，P<0.05为差异有显著性意义，高浓度组在0～72 h时，P<0.01为差异有非常显著性意义，低剂量组差异无统计学意義。见表5。
3 讨论
通过调研搜集了20余种佤药，均为当地佤医常用的肝病用药，进一步查阅文献，随机抽选5种药材进行细胞实验的初筛，下一步拟扩大筛选范围，以期发掘更多治疗肝病有效的佤药。5号药的功效为清热解毒，利水消肿，佤族地区常用于治疗急性黄疸型肝炎;8号药的功效为益气健脾，清热安神，佤族地区常用于治疗病毒性肝炎;10号药的功效为祛风除湿，续筋接骨，佤族地区常用于治疗黄疸型肝炎;23号药的功效为清热解毒，利湿退黄，佤族地区常用于治疗湿热黄疸;24号药的功效为清热解毒，佤族地区常用于治疗各型肝炎[8]。实验表明，除了药物C外，其余药物均对肝星状细胞的生长均有一定的抑制作用，且BDE三个药物的高浓度组在0-72h时均有非常显著的统计学意义（P<0.01），表明对治疗肝纤维化具有一定的临床意义。但本实验依然存在一些实际性的问题，由于佤族习用肝病用药一直以来仅作为云南少数民族地区的治疗肝病用药，对于这些药的深入研究比较少，尤其是作用到细胞上更是缺乏研究，所以在浓度的设定上没有一个规定的参照标准。本实验设置了3个浓度，通过观察其在两个浓度区间的作用效果，可对佤族习用肝病用药有效抑制浓度在一个大的浓度区间进行初步筛选，所筛选得到的浓度并不一定是佤族习用肝病用药的最佳抑制浓度，为得到这些药的最佳抑制浓度可在不同浓度梯度进行实验，本文在此不再赘述;其次本次实验载体为大鼠肝星状细胞，还未对活体大鼠进行下一步的实验，故无法排除所测得的浓度以不同方式给药对活体大鼠中肝星状细胞抑制作用情况的影响。
佤族聚居地多属于亚热带低纬度地区，雨量充沛，山多林密，气候温热，适合多种动植物生长，丰富的动植物是佤药的来源。佤族医药作为我国民族医药的重要组成部分，皆起源于生产、生活和医疗实践的经验总结，在漫长的历史发展过程中，为本民族防病治病、生存繁衍，起到了重要的作用，至今仍在广泛应用。只有进一步对佤族医药进行系统的挖掘、整理、分析和研究，才能更好的使之服务于临床为人们解除病痛。
参考文献：
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[8]郭大昌，郭绍荣，段桦.中国佤族医药[M].昆明：云南民族出版社，1997.
（收高日期：2019-09-12）
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