采用响应曲面法对Capto adhere填料进行工艺优化

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　　摘 要 为对复合阴离子Capto adhere 填料进行纯化工艺优化，在前期单因素试验基础上，CHO细胞表达的IgG1型单克隆抗体细胞培养上清液经亲和层析纯化后，采用中心复合表面设计（CCF）法优化Capto adhere 填料纯化工艺。以收率、纯度、HCP清除率为响应变量，考察pH、电导率、载量3个关键因素对纯化工艺的影响，拟合模型并验证。优化后最佳工艺条件为：pH 7.0，电导率 16.4 ms/cm，载量300 mg/ml，在此条件下，收率、纯度和HCP清除率分别可达（90.77±0.77）%、 （99.55±0.05）%和（88.93±2.14）%。与预测结果偏差均<5%，模型得到验证。试验结果表明本研究Capto adhere 填料工艺优化是有效可行的。
　　关键词 中心复合设计 Capto adhere 抗体纯化
　　中图分类号：TQ464.7 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2020）09-0067-05
　　Optimization of Capto adhere purification conditions using response surface design
　　WU Guanghao1*， HE Huidan1， XU Chongfan1， GU Xin1， LIU Yanjun2
　　（1. Shanghai Jiaolian Drug Research and Development Co.， Ltd.， Shanghai 201210， China； 2. Central Research Institute， Shanghai Pharmaceuticals Holding Co.， Ltd.， Shanghai 201210， China）
　　ABSTRACT In order to optimize the purification process of multimodal anion exchange chromatography media Capto adhere， the purification process by Capto adhere was optimized by central composite surface design method after the cell culture supernatant for the expression of monoclonal antibody IgG1 in CHO cells was purified by affinity chromatography. The effects of three key factors such as pH value， conductivity and load on the purification process were investigated using the yield， purity and HCP removal rate as responses， and then the fitting model was validated. The conditions for optimum process were pH 7.0， conductivity 16.4 ms/cm and load 300 mg/ml. The results showed that the yield， purity and HCP removal rate were（90.77±0.77）%， （99.55±0.05）% and （88.93±2.14）%， respectively. The deviations from the predicted results were all less than 5% and the model was validated. The experimental results show that the optimization of purification process by Capto adhere is effective and feasible.
　　KEy WORDS center composite design； Capto adhere； antibody purification
　　近年來，治疗性单克隆抗体（monoclonal antibodies，mAbs）药物在许多疾病治疗（如癌症）方面扮演着重要的角色，该治疗方法需要在长时间内供给高剂量的抗体[1]。面对高需求量的单克隆抗体药物市场，生物公司需要开发新的上下游抗体工艺以减小生产成本。对于上游单抗生产来说，现在的抗体滴度已能达到5～10 g/L；对于下游的抗体纯化来说，一般的三步纯化步骤可占总生产成本的50%～80%[2]：首先通过亲和层析捕获目的蛋白同时去除大量的宿主细胞蛋白残留（host cell protein， HCP），DNA以及病毒；然后通过两步纯化（中度纯化、精细纯化，通常为离子交换层析和疏水层析的组合）进一步去除HCP、聚体以及蛋白A（protein A，PA）[3-4]。为提高纯化效率和抗体收率，减少生产成本，复合层析填料应运而生。
　　Capto adhere是一种应用于生物过程技术的复合阴离子填料，配基为N-苄基-N-甲基乙醇胺，该配基同时具有：①离子相互作用；②氢键作用；③疏水作用。在流穿模式下，Capto adhere可吸附HCP，PA，病毒，内毒素等，而抗体流穿，一步去除关键杂质，可与亲和层析结合组成两步纯化工艺进而达到提高收率的目的[5]。
　　试验设计（design of experiments，DOE）是一种基
　　于数理统计原理研究多个因子与响应变量关系的一种科学有效的方法，其中响应曲面法在生物过程优化应用中最为广泛[6]。为实现流穿模式下Capto adhere填料性能的最优化，本试验在前期单因素试验基础上，采用试验设计的方法，对三种关键工艺参数pH，电导率，载量进行优化，作为放大生产的依据。 　　1 材料和方法
　　1.1 材料
　　AKTA avant、填料Mabselect及填料Capto adhere（柱体积CV=1.7 ml）购自美国GE公司；层析柱购自美国Millipore公司；无水枸橼酸、二水合枸橼酸钠（湖南尔康制药股份有限公司）；Tris（Applichem Gmbh-An ITW公司）。
　　培养液是经上游CHO细胞培养表达的IgG1单克隆抗体（自主研制生产），经过Mabselect亲和层析纯化后得到800 ml样品，浓度为13.7 mg/ml，纯度为98.2%，HCP残留的体积分数为0.297 1%。
　　1.2 方法
　　1.2.1 中心复合表面设计
　　在前期的单因素试验中，确定pH、电导率、载量的范围分别为：5～7，3～20 ms/cm，100～300 mg/ml。根据CCF试验设计原理采用Design-Expert V8.0.6.1（Stat-Ease Inc.， Minneapolis， MN）进行响应曲面设计（表1）。
　　选择中心点重复试验3次，系统生成17个试验，包括8个角点，6个轴点，1个中心点（重复试验3次），未设计分组。本次试验按照系统所生成的随机顺序进行（表2）。
　　1.2.2 样品处理
　　配制20 mmol/L枸橼酸缓冲液，pH和电导率如表2，然后分别用1 mol/L Tris溶液和20 mmol/L枸橼酸+1 mol/L NaCl溶液调节pH和电导率使与缓冲液一致，样品来源于Mabselect亲和层析纯化得到的产物。
　　1.2.3 色谱条件
　　将Capto adhere层析柱用20 mmol/L枸橼酸缓冲液充分平衡后，以0.4 ml/min的上样速度上样，达到相应条件下的载量。再用平衡缓冲液充分平衡并收集流穿液。
　　2 结果
　　将表2数据输入软件Design-Expert V8.0.6.1，获得试验分析结果。试验数据分析分为以下几个部分：模型拟合；模型诊断及ANOVA分析；模型分析及验证。设定响应值上下限分别为收率90%～100%，纯度99%～100%，HCP清除率0～100%，利用软件分析生成响应曲面，在给定因子水平范围内得出最佳点及操作范围并对最终模型进行验证。
　　分别对响应变量收率，纯度，HCP清除率及3因子pH，电导率，载量进行二阶模型拟合，各响应变量拟合方程分别为：
　　Y1，Y2，Y3分别代表响应变量收率，纯度及HCP清除率；A，B，C分别代表因子pH，电导率和载量。结果表明，二阶方程（1）、（2）、（3）线性拟合程度良好，对应R2分别为0.73，0.81，0.92，表示模型分别能够解释73%，80%，92%的均值方差；变异系数CV值分别为4.14%，0.18%，4.12%，，该试验结果表明试验值与预测值偏差较小，具有较高的精度，并且试验具有高度可靠性；信噪比分别为8.353，9.558，11.041，一般来说，信噪比大于4说明具有较高的信号值[7]，3个模型信噪比均大于4，说明试验信号良好。总体来说，3个响应变量与独立因子pH，电导率，载量的回归模型均具有较高的线性拟合度及可靠性。
　　2.1 模型诊断及ANOVA分析
　　观察残差正态性检验图及残差相对于观测值顺序为横轴的散点图，残差符合正态分布，无明显奇异点（图未给出）；Box-Cox图显示l均等于1（图未给出），表明数据符合正态性分布，无须做幂次变换。
　　收率响应曲面拟合方程方差分析结果如表3所示。
　　纯度响应曲面拟合方程方差分析结果如表4所示。
　　纯度响应曲面拟合方程方差分析结果如表5所示。
　　以上ANOVA分析结果显示回归模型均具有显著性（P值均小于0.05），其中响应变量纯度及HCP清除率拟合模型具有极显著性（P值均小于0.01）。對模型进行失拟检验，失拟项（lack of fit）F值为失拟平方和与纯误差平方和的比值，在三个模型中，失拟项F值均较低，P值分别为0.099 9，0.079 0，0.388 6，均大于0.05，表明模型拟合良好，模型可信。
　　2.2 模型分析验证
　　根据试验模型拟合出响应曲面图及等高线图可以直观地看出响应变量与各水平因子之间的关系及各因子之间的相互作用（图1）。等高线越密集说明响应变量对因子的变化越为敏感，载量设定为300 mg/ml时，固定电导率，随着pH的增加，收率和纯度也将增加，并且增幅较大，而HCP清除率随之减少；固定pH，随着电导率的增加，纯度和HCP清除率相应减小，而收率变化呈“U”型，这些结果均说明需将各因子调整至合适水平以达到给定水平范围内最佳效果。
　　根据软件给出的最佳点，将pH调至7.00，电导率调至16.4 ms/ml，载量300 mg/ml，对该最佳点进行工艺验证，在该条件下重复试验两次，所得结果为收率（90.77±0.77）%，与预测值（94.67%）相差4.12%，纯度（99.55±0.05）%，与预测值（99.27%）相差0.29%，HCP清除率（88.93±2.14）%，与预测值（87.07%）相差2.00%。结果偏差均<5%。说明所拟合响应曲面模型具有较好的可信度和预测精度。 　　將响应值上下限分别设定为收率90%～100%，纯度 99%～100%，HCP清除率0～100%，利用软件分析得出操作区间如图2所示，随着载量的增加，操作区域也继续增加，考虑到pH，电导率及载量的调控难易程度，将载量操作范围确定为250～300 mg/ml，pH操作范围设定为6.8～7.0，从而可确定电导率操作范围为11.8～18.0 ms/cm（图2A）。
　　3 讨论
　　为提高收率及纯度，有必要对下游的抗体纯化工艺进行优化，而亲和层析往往是第一步。由于Protein A亲和层析具有的高性能，其对单抗具有高度的选择性，并且单抗在经过Protein A亲和层析步后，能够达到很高的纯度，因此很难找到能够替代该填料的选择以取代该步骤[8]。而在纯化的后续步骤中，若能将多步纯化步骤整合为一步，将大大提高生产效率。使用复合填料可整合离子交换及疏水层析，是纯化工艺的一大趋势。为确定复合填料Capto adhere范围内的最佳工艺条件，在本次实验中，我们采用响应曲面的方法进行DOE设计，对复合填料Capto adhere工艺条件进行优化，条件优化后的收率达（90.77±0.77）%，纯度达（99.55±0.05）%，相对于传统三步层析纯化，本研究采用亲和层析、Capto adhere两步纯化步骤，有效地提高了收率及纯度，降低了成本。
　　一般来说，对于3因子3水平的DOE实验，采用中心复合序贯设计的方法设计实验点是较为常见的方法，设计点包括8个角点，6个星点及一个中心点，星点为给定范围之外的点。该种方法特点是具有序贯性和旋转性[9]，响应变量的预测精度在以设计中心为球心的球面上是相同的。本研究采用中心复合表面设计而非中心复合序贯设计，使得设计点均在给定范围之内，原因是本次试验中电导率设计范围为3～20 ms/cm，若采用中心复合序贯设计，取给定范围之外的星点，则设计点将存在负值，对于电导率来说，不存在负值。此外，由于抗体经亲和层析所得样品电导率为1 ms/cm左右，电导率调至过高将消耗大量盐，考虑工艺放大时的生产成本，将实验点设计在给定范围之内，故而采用中心复合表面设计，这也是响应曲面未出现峰值的原因。
　　本研究中，收率拟合模型R2=0.73，这可能是由于试验过程中采用手动收样，存在收样误差而导致数据拟合略有偏差，从而导致R2值相较于纯度及HCP清除率响应模型拟合R2值略低。ANOVA分析结果显示电导率及载量对收率有显著影响，pH影响不显著，且收率均较高，这可能是由于pH 5～7的范围均小于蛋白等电点（pI=8.7），较低的pH下，蛋白带正电，静电相互作用力将变弱，进而导致较高的收率[10]。载量对于纯度及HCP清除率均无显著影响，原因可能是载量试验范围较小（100～300 mg/ml），导致影响不显著。
　　复合填料的出现使得纯化步骤精简、成本降低、收益提高成为可能；DOE使得工艺开发及优化试验次数大大减少；为实现该填料的性能最大化，其工艺开发和优化还有待进一步深入研究。
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