矮地茶黄酮对大鼠肝纤维化保护作用及机制研究

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　　[摘要]目的 研究矮地茶黃酮对肝纤维化的保护作用及相关机制。方法 随机将60只大鼠分为正常组、模型组、矮地茶黄酮高剂量组（600 mg/kg）、矮地茶黄酮中剂量组（400 mg/kg）和矮地茶黄酮低剂量组（200 mg/kg），每组各12只。采用腹腔注射0.5%二甲基亚硝胺的方法制备肝纤维化模型，同时，各用药组灌服矮地茶黄酮，每天1次，共8周。观察大鼠的一般形态，检测大鼠血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、透明质酸（HA）、层粘连蛋白（LN）水平，苏木素-伊红（HE）染色观察大鼠的肝脏变化，免疫组化方法检测各组大鼠调控转化生长因子-β1（TGF-β1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、基质金属蛋白酶-1（MMP-1）及基质金属蛋白酶抑制剂-1（TIMP-1）表达情况。结果 矮地茶黄酮高、中剂量组大鼠的血清ALT、AST、MDA、HA、LN水平低于模型组，SOD水平高于模型组，肝脏炎症程度和纤维化程度均好于模型组，TGF-β1、TNF-α、TIMP-1表达阳性率低于模型组，MMP-1表达阳性率高于模型组，差异均有统计学意义（P<0.05）;矮地茶黄酮低剂量组大鼠的血清ALT、AST、MDA、LN水平低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05），SOD、HA水平与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05），炎症程度及纤维化程度与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05），TGF-β1、TNF-α、MMP-1及TIMP-1的表达阳性率与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。结论 矮地茶黄酮对肝纤维化具有保护作用，并与剂量有关;其作用机制可能与保护肝细胞、降低炎症程度、防止氧化应激的发生，抑制肝星状细胞的活化、减少细胞外基质形成有关。
　　[关键词]矮地茶黄酮;肝纤维化;二甲基亚硝胺;免疫组化
　　[中图分类号] R285.5          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-4721（2020）5（a）-0004-05
　　Protective effect and mechanism of flavonoids of Ardisa japonica on liver fibrosis in rats
　　CAO Qing-sheng1   LI Zhi-chao2▲   HAN Li-wang1
　　1. Department of Pathology， Yutian Hospital of Tangshan City in Hebei Province， Yutian   064100， China; 2. Department of Pain， Yutian Traditional Chinese Medicine Hospital of Tangshan City in Hebei Province， Yutian   064100， China
　　[Abstract] Objective To study the protective effect and mechanism of flavonoids of Ardisa japonica （FAJ） on liver fibrosis. Methods Sixty rats were randomly divided into a normal control group， a model group， a high-dose of FAJ group （600 mg/kg）， a medium-dose of FAJ group （400 mg/kg）， and a low-dose of FAJ group （200 mg/kg）， with 12 rats in each group. Hepatic fibrosis model was prepared by intraperitoneal injection of 0.5% dimethylnitrosamine. At the same time， each group with intervention was administered with FAJ once a day for 8 weeks. The general morphology of rats was observed. The levels of serum alanine aminotransferase （ALT）， aspartate aminotransferase （AST）， superoxide dismutase （SOD）， malondialdehyde （MDA）， hyaluronic acid （HA）， and laminin （LN） were tested. The changes of liver in rats were observed via hematoxylin-eosin （HE） staining， and the expression of transforming growth factor-β1 （TGF-β1）， tumor necrosis factor-α （TNF-α）， matrix metalloproteinase-1 （MMP-1）， tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1 （TIMP-1） was detected using immunohistochemical methods. Results The levels of ALT， AST， MDA， HA， and LN in the serum of rats in the high and medium-dose of FAJ groups were lower than those in the model group， and the SOD levels were higher than those in the model group， the degree of inflammation and fibrosis of liver was better compared with that in the model group， the positive rates of expression of TGF-β1， TNF-α， TIMP-1 were lower than those of the model group， and the positive rates of expression of MMP-1 were higher than those of the model group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The serum levels of ALT， AST， MDA， and LN in rats in the low-dose of FAJ group were lower than those in the model group， and the differences were statistically significant （P<0.05）. There were no significant differences in the levels of SOD or HA when compared with the model group （P>0.05）. There were no significant differences in the degree of inflammation and fibrosis compared with the model group （P>0.05）. There were no significant differences in the positive rates of expression of TGF-β1， TNF-α， MMP-1 or TIMP-1 compared with the model group （P>0.05）. Conclusion The FAJ has protective effect on liver fibrosis in a dose-related manner. The mechanism may be related to protecting liver cells， reducing the degree of inflammation， preventing the occurrence of oxidative stress， inhibiting the activation of hepatic stellate cells， and decreasing the formation of extracellular matrix. 　　[Key words] Flavonoids of Ardisa japonica; Liver fibrosis; Dimethylnitrosamine; Immunohistochemistry
　　中药黄酮类在肝纤维化的防治方面具有多靶点、副作用小、价格低等优势，有抗氧化、抑制肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）合成与分泌，调控转化生长因子-β1/蛋白信号通路（transforming growth factor-β，TGF-β1/Smad信号通路）、调节炎症反应的作用，对肝纤维化具有很好的防治作用[1-5]。矮地茶是紫金牛科紫金牛Ardisia japonica（Hornst.） B1的干燥全草，其味辛、微苦，归肺、肝经。具有清热解毒，化痰止咳、活血化瘀的功效，常用于治疗咳嗽、咳痰、慢支、风湿、水肿、黄疸等。现代药理学表明，矮地茶主要成分为黄酮类化合物，具有抑癌、抗病毒、降血糖等药理作用[6-8]。矮地茶黄酮对二甲基亚硝胺诱导的肝纤维化的保护作用及机制研究，国内报道较少。因此，本研究通过给大鼠腹腔注射二甲基亚硝胺诱导肝纤维化模型，灌服矮地茶黄酮进行干预，来研究其对化学性肝纤维化的保护作用及机制，现报道如下。
　　1对象与方法
　　1.1实验动物
　　选取60只无特定病原体级别（specific pathogen free，SPF）斯泼累格·多雷（sprague dawley，SD）大鼠，体重180～220 g，60 d左右，均为雄性，由桂林医学院动物实验中心提供，并在动物实验中心完成肝纤维化模型制备及药物干预;许可证号：SCXK2013-0001。
　　1.2药物与试剂
　　矮地茶购于桂林市六合路中药材市场，矮地茶黄酮由桂林医学院张可锋教授制备;丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）试剂盒购自希森美康生物科技公司;超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、透明质酸（hyaluronic acid，HA）、层粘连蛋白（laminin，LN）试剂盒购自南京建成生物工程研究所;TGF-β1、TNF-α、基质金属蛋白酶-1（matrix metalloproteinase，MMP-1）及基质金属蛋白酶抑制剂-1（tissueinhibitor of matrix metalloproteinase-1，TIMP-1）购自福州迈新生物技术开发有限公司;贝克曼 奥林巴斯AU5821全自动生化仪。
　　1.3模型制备及药物干预
　　适应性喂养2 d后， 随机将大鼠分为正常组、模型组、矮地茶黄酮低剂量组、矮地茶黄酮中剂量组和矮地茶黄酮高剂量组，每组各12只。药物干预：矮地茶黄酮组按600、400、200 mg/kg灌胃给药，每天1次至实验结束。正常组和模型组用蒸馏水代替药物灌服。大鼠肝纤维化模型制备参考高雅等[9]制备肝纤维化模型方法：除正常组外，模型组和矮地茶黄酮组均按2 ml/kg剂量腹腔注射0.5%二甲基亚硝胺，隔天注射1次，共8周，待实验结束时，结合大鼠的一般形态、血清学指标、肝脏病理学等判断肝纤维化模型是否成功。
　　1.4观察指标及评价标准
　　实验结束后，颈椎脱臼法处死大鼠，采集大鼠眼球血液及肝组织标本，检测各组大鼠血清中ALT、AST、MDA、SOD、HA、LN水平，病理学观察各组大鼠的肝脏炎症程度和纤维化程度，判断标准参考慢性乙型肝炎防治指南（2015年更新版）Metavir评分系统[10]。
　　Metavir評分系统——肝组织炎症活动度评分：A0=没有活动;A1=轻度活动;A2=中等活动;A3=重度活动。
　　Metavir评分系统——肝组织纤维化分期评分：F0=无纤维化;F1=汇管区纤维性扩大，但无纤维间隔形成;F2=汇管区纤维性扩大，少数纤维间隔形成;F3=多数纤维间隔形成，无硬化结节;F4=肝硬化。
　　免疫组化方法检测各组大鼠肝脏TGF-β1、TNF-α、MMP-1及TIMP-1的表达情况。
　　1.5统计学方法
　　采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，计数资料以率（%）表示，采用χ2检验;等级资料采用秩和检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
　　2结果
　　2.1各组大鼠的一般形态观察
　　实验过程中，正常组大鼠毛色、食量无明显变化，大、小便正常，无死亡。模型组大鼠从第2周开始毛色变黯淡，进食明显减少，精神萎靡，至第4周，大鼠体重降低，消瘦，部分大鼠腹腔有腹水形成，实验结束时，模型组大鼠死亡3只。矮地茶黄酮高、中剂量组大鼠毛色变化不明显，进食稍影响，体重和腹水变化不明显，实验结束时，矮地茶黄酮高剂量组大鼠死亡1只，矮地茶黄酮中剂量组大鼠死亡2只。矮地茶黄酮低剂量组大鼠毛色黯淡，进食少，体重降低，2只有腹水形成，实验结束时，死亡2只。
　　2.2各组大鼠血清ALT、AST、SOD、MDA、HA、LN水平的比较
　　模型组大鼠的血清ALT、AST、MDA、HA、LN水平高于正常组，SOD水平低于正常组，差异有统计学意义（P<0.05）;矮地茶黄酮高、中剂量组大鼠的血清ALT、AST、MDA、HA、LN水平低于模型组，SOD水平高于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）;矮地茶黄酮低剂量组大鼠血清中ALT、AST、MDA、LN水平低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05），SOD、HA水平与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05）;矮地茶黄酮高、中剂量组大鼠的血清ALT、AST、MDA水平低于矮地茶黄酮低剂量组，SOD水平高于矮地茶黄酮低剂量组，差异有统计学意义（P<0.05）;矮地茶黄酮高剂量组大鼠的血清HA、LN水平低于矮地茶黄酮低剂量组，差异有统计学意义（P<0.05）;矮地茶黄酮中剂量组大鼠的血清HA水平低于矮地茶黄酮低剂量组，差异有统计学意义（P<0.05），矮地茶黄酮中剂量组大鼠的血清LN水平与矮地茶黄酮低剂量组比较，差异无统计学意义（P>0.05）;矮地茶黄酮高剂量组与矮地茶黄酮中剂量组大鼠血清ALT、AST、SOD、MDA、HA、LN水平比较，差异均无统计学意义（P>0.05）（表1）。 　　2.3各组大鼠肝脏病理形态学的比较
　　正常组大鼠肝脏颜色红润，表面光滑，质地柔软，有光泽;模型组与正常组大鼠比较，大鼠肝脏颜色灰黄、光滑度下降，表面结节状且边缘不规则，质地变硬，无光泽，体积缩小;各用药组大鼠肝脏颜色、质地、大小及表面光滑度好于模型组。显微镜观察病理切片显示，正常大鼠肝细胞沿中央静脉放射状排列，细胞大小正常，结构完整，无变性、坏死及间质炎细胞浸润;模型组大鼠肝细胞排列紊乱，肝细胞片状坏死，汇管区大量炎症细胞浸润，胶原纤维增生，有宽大的纤维间隔，甚至假小叶形成。矮地茶黄酮高、中剂量组大鼠肝组织变性坏死、炎症程度及纤维化程度与模型组比较，改善较明显，胶原分布显著减少，纤维间隔变细，肝小叶结构基本完整。矮地茶黄酮低剂量组部分大鼠肝细胞变性坏死及纤维化程度改善不明显，汇管区大量炎症细胞浸润，胶原纤维增生明显，假小叶形成（图1，封三）。
　　2.4各组大鼠的肝脏纤维组织增生情况
　　免疫组织化学方法染色，用Vimentin观察各组大鼠的肝脏纤维组织增生情况，结果显示，模型组大鼠肝脏汇管区Vimentin弥漫阳性，染色范围及强度均高于正常组;矮地茶黄酮高、中剂量组染色范围及强度低于模型组（图2，封三）。
　　2.5矮地茶黄酮对各组大鼠肝组织炎症程度、纤维化程度的影响
　　矮地茶黄酮高、中剂量组大鼠肝脏的炎症程度低于模型组，差异有统计学意义（Z=10.86、9.83，P<0.05）;矮地茶黄酮低剂量组大鼠肝脏的炎症程度与模型组比较，差异无统计学意义（Z=0.09，P>0.05）。矮地茶黄酮高、中剂量组大鼠肝脏的纤维化程度低于模型组，差异有统计学意义（Z=14.61、13.65，P<0.05）;矮地茶黄酮低剂量组大鼠肝脏的纤维化程度与模型组比较，差异无统计学意义（Z=0.06，P>0.05）;矮地茶黄酮高、中剂量组大鼠肝脏中的炎症程度低于矮地茶黄酮低剂量组，差异有统计学意义（Z=11.65、10.57，P<0.05），矮地茶黄酮高、中剂量组大鼠肝脏中的纤维化程度低于矮地茶黄酮低剂量组，差异有统计学意义（Z=15.27、14.29，P<0.05），矮地茶黄酮高剂量组大鼠肝脏的炎症程度和纤维化程度与矮地茶黄酮中剂量组比较，差异无统计学意义（Z=0.71、1.03，P>0.05）（表2～3）。
　　2.6各组大鼠肝组织TGF-β1、TNF-α、MMP-1及TIMP-1表达阳性率的比较
　　模型组大鼠肝組织的TGF-β1、TNF-α、TIMP-1表达阳性率高于正常组，MMP-1表达阳性率低于正常组，差异有统计学意义（χ2=14.32、13.63、13.63、10.52，P<0.05）。
　　矮地茶黄酮高、中剂量组大鼠肝脏中的TGF-β1表达阳性率低于模型组，差异有统计学意义（χ2=4.09、4.56，P<0.05）;矮地茶黄酮低剂量组大鼠肝脏中的TGF-β1表达阳性率与模型组比较，差异无统计学意义（χ2=0.95，P>0.05）;矮地茶黄酮高、中剂量组大鼠肝脏中的TGF-β1表达阳性率低于矮地茶黄酮低剂量组，差异有统计学意义（χ2=8.42、5.49，P<0.05），矮地茶黄酮高剂量组大鼠肝脏的TGF-β1表达阳性率与矮地茶黄酮中剂量组比较，差异无统计学意义（χ2=0.04，P>0.05）。
　　矮地茶黄酮高、中剂量组大鼠肝脏中的TNF-α表达阳性率低于模型组，差异有统计学意义（χ2=7.59、4.86，P<0.05），矮地茶黄酮低剂量组大鼠肝脏中的TNF-α表达阳性率与模型组比较，差异无统计学意义（χ2=0.01，P>0.05）;矮地茶黄酮高、中剂量组大鼠肝脏中的TNF-α表达阳性率低于矮地茶黄酮低剂量组，差异有统计学意义（χ2=8.41、5.49，P<0.05），矮地茶黄酮高剂量组大鼠肝脏的TNF-α表达阳性率与矮地茶黄酮中剂量组比较，差异无统计学意义（χ2=0.38，P>0.05）。
　　矮地茶黄酮高、中剂量组大鼠肝脏中的MMP-1表达阳性率高于模型组，差异有统计学意义（χ2=5.05、4.33，P<0.05），矮地茶黄酮低剂量组大鼠肝脏中的MMP-1表达阳性率与模型组比较，差异无统计学意义（χ2=0.15，P>0.05）;矮地茶黄酮高、中剂量组大鼠肝脏中的MMP-1表达阳性率与矮地茶黄酮低剂量组比较，差异无统计学意义（χ2=3.83，3.20，P>0.05），矮地茶黄酮高剂量组大鼠肝脏的MMP-1表达阳性率与矮地茶黄酮中剂量组比较，差异无统计学意义（χ2=0.02，P>0.05）。
　　矮地茶黄酮高、中剂量组大鼠肝脏中的TIMP-1表达阳性率低于模型组，差异有统计学意义（χ2=9.89、4.86，P<0.05），矮地茶黄酮低剂量组大鼠肝脏中的TIMP-1表达阳性率与模型组比较，差异有统计学意义（χ2=0.28，P>0.05）;矮地茶黄酮高量组大鼠肝脏中的TIMP-1表达阳性率低于矮地茶黄酮低剂量组，差异有统计学意义（χ2=8.03，P<0.05），矮地茶黄酮中剂量组大鼠肝脏中的TIMP-1表达阳性率与矮地茶黄酮低剂量组比较，差异无统计学意义（χ2=3.33，P>0.05），矮地茶黄酮高剂量组大鼠肝脏的TIMP-1表达阳性率与矮地茶黄酮中剂量组比较，差异无统计学意义（χ2=1.22，P>0.05）（表4）。
　　3讨论
　　肝纤维化的发生涉及多个信号转导通路和复杂的分子机制，与肝细胞损伤、炎症反应、氧化应激、肝星状细胞增殖、基质成分增加等关系密切[11-19]。本课题前期研究表明[20]，矮地茶黄酮对四氯化碳致小鼠急性肝损伤有保肝作用，作用机制与降低肿瘤坏死因子、白介素-6等致炎因子，减轻炎症反应有关。因此，本研究通过观察各组大鼠的血清ALT、AST、SOD、MDA、HA、LN水平，肝脏炎症程度和纤维化程度，TGF-β1、TNF-α、MMP-1及TIMP-1的表达情况，来分析矮地茶黄酮对肝纤维化的保护作用及机制。 　　本研究中，模型组大鼠肝脏灰黄，表面结节状且边缘不规则，质地变硬，体积缩小，结合肝脏病理形态，肝脏纤维组织增生，假小叶形成，符合肝纤维化。本研究结果显示，模型组大鼠的血清ALT、AST、MDA、HA、LN水平高于正常组，SOD水平低于正常组，差异有统计学意义（P<0.05），ALT、AST明显升高，提示肝纤维化大鼠有肝损伤;MDA水平升高，SOD水平降低，证实氧化应激在二甲基亚硝胺诱导的肝纤维化中发挥着重要作用。TGF-β1、TNF-α、TIMP-1表达升高，MMP-1降低，提示其在二甲基亚硝胺诱导的肝纤维化中亦发挥着重要作用，作用机制与促炎、促进肝星状细胞增殖与活化、减少细胞外基质降解有关。矮地茶黄酮高、中剂量组大鼠肝脏颜色、质地、大小及表面光滑度好于模型组，大鼠肝组织變性、坏死及纤维化程度好于模型组，矮地茶黄酮高、中剂量组大鼠的血清ALT、AST、HA、LN水平低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05），矮地茶黄酮低剂量组改善效果不明显，提示矮地茶黄酮有保肝作用且与剂量有关。矮地茶黄酮高剂量组、中剂量组大鼠血清MDA水平低于模型组，SOD水平高于模型组，差异有统计学意义（P<0.05），提示矮地茶黄酮可以减少脂质过氧化，提高机体抗氧化能力。矮地茶黄酮高、中剂量组大鼠的肝脏炎症程度低于模型组，且TNF-α表达阳性率低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05），提示矮地茶黄酮具有很好的抗炎作用。肝星状细胞活化的标志物TGF-β1表达明显降低，提示矮地茶黄酮具有很好的抑制肝星状细胞活化作用。矮地茶黄酮高剂量组、中剂量组大鼠肝脏的纤维化程度与模型组比较，改善较明显，胶原分布显著减少，纤维间隔变细，肝小叶结构基本完整，血清HA、LN水平明显降低，MMP-1表达增高及TIMP-1表达降低，提示矮地茶黄酮有改善肝纤维化的作用，作用机制为通过调节MMP-1水平，促进胶原蛋白的降解，抑制肝纤维化的进展。
　　综上所述，矮地茶黄酮对肝纤维化具有保护作用，并与剂量有关，其作用机制可能与保护肝细胞、降低炎症程度、防止氧化应激的发生，抑制肝星状细胞的活化、减少细胞外基质形成有关。
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　　（收稿日期：2019-11-14  本文编辑：闫  佩）
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