干旱胁迫对杜鹃叶片超微结构的影响

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　　摘要：以胭脂蜜（Rhododendron obtusum cv. Yanzhimi）、花蝴蝶（Rhododendron obtusum cv. Huahudie）和西施（Rhododendron obtusum cv. Xishi）3个杜鹃品种为研究试材，在光照培养箱内采用盆栽控水法进行干旱胁迫处理，利用透射电镜观测叶片细胞超微结构。结果表明，杜鹃叶片叶绿体和线粒体都随干旱胁迫的程度加深而受到损坏，叶绿体对于水分的亏缺较线粒体更加敏感。对于抗旱性较强的胭脂蜜，质壁分离出现更晚，叶绿体和线粒体的损伤程度更轻，叶片细胞结构对于杜鹃抗旱性强弱的决定作用较大。
　　关键词：杜鹃;干旱胁迫;抗旱性;超微结构;透射电镜
　　中图分类号：S685.21         文献标识码：A
　　文章编号：0439-8114（2019）24-0136-06
　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.24.033           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　Effect of drought stress on leaf ultrastructure of Rhododendron L.
　　ZHOU Yuan1，TONG Jun1，MAO Jing1，XU Dong-yun1，FANG Lin-chuan1，DONG Yan-fang1，
　　LIU Yi-man1，GUO Cai-xia2，TAN Qing2，YANG Jun-juan3，ZHU An-xin3
　　（1.Institute of Forestry & Fruit-tree，Wuhan Academy of Agricultural Sciences/Hubei Engineering Technology Research Center of Landscape Plant，Wuhan 430075，China;2.Wuhan Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430065，China;3.Jiangxia Forestry Science and Technology Promotion Station，Wuhan 430000，China）
　　Abstract： Using transmission electron microscope， the leaf ultrastructure were investigated in Rhododendron obtusum cv. Yanzhimi， Rhododendron obtusum cv. Huahudie and Rhododendron obtusum cv. Xishi under drought stress in light incubator. The results showed that the damage of mitochondria and chloroplast increased as the drought degree increased， and chloroplast was more sensitive than mitochondria to the external environment. The plasmolysis appeared later in Rhododendron obtusum ‘Yanzhimi’ with relatively highest drought resistance. In which， the chloroplast and mitochondria were less damaged. There was an important association between leaf cell structure and drought resistance in Rhododendron L..
　　Key words： Rhododendron L.; drought stress; drought resistance; ultrastructure; transmission electron microscope （TEM）
　　杜鵑（Rhododendron L.）是对杜鹃花科杜鹃花属植物的总称。杜鹃因花色丰富，开花时花朵繁密，绮丽多姿，在众多园林植物中享有独特的地位，被列入“世界三大园林植物”“中国三大天然名花”，同时是中国十大传统名花之一，享有“木本花卉之王”的美誉，是世界著名的观赏花卉，有极高的园林应用价值、经济价值和生态价值。但国内杜鹃应用主要以盆景盆花为主，在园林绿化方面市场应用品种极少，主要品种仅1～2种，花量少，花型简单，且花色单一，综合观赏价值较差，常用作绿篱而非花篱种植。中国目前正在大力发展园林城市，重视城市环境的绿化和美化，花卉产业飞速发展，市场对杜鹃的需求越来越大，虽然国内拥有着丰富的杜鹃资源，但开发利用的品种较少。城市绿化中通常面临最严重的问题是干旱，即使在南方地区也存在季节性缺水，加之目前园林管理养护能力较低，造成杜鹃在城市园林中的应用受到很大程度的限制，干旱对杜鹃的伤害是杜鹃应用中亟待解决的问题。对具较高观赏价值、较强抗旱能力和适应能力的杜鹃进行抗旱机制的研究，开发培育更耐旱的杜鹃品种，实现生物节水，是推广杜鹃园林绿化应用的一种有效方式。
　　对干旱胁迫下杜鹃叶片超微结构变化开展了研究，从细胞学角度探讨不同杜鹃品种对干旱胁迫响应的差异，丰富杜鹃抗旱研究内容，为后期的抗旱分子机制研究奠定基础，为选育抗旱性较强的杜鹃优良品种提供理论依据。有助于充分利用国内丰富的杜鹃资源，开展引种、驯化等工作，使杜鹃在城市园林绿化中得到更广泛的应用。 　　1  材料与方法
　　1.1  材料
　　试验于武汉市农业科学院林业果树科学研究所实验室进行，供试品种为胭脂蜜（Rhododendron obtusum cv. Yanzhimi）、花蝴蝶（Rhododendron obtusum cv. Huahudie）和西施（Rhododendron obtusum cv. Xishi）。选择3个品种长势良好、株形一致、无病虫害的3年生扦插盆栽苗为试验材料。前期干旱试验观测结果表明，不同品种抗旱性为胭脂蜜>西施>花蝴蝶。
　　1.2  方法
　　将3个杜鹃品种（胭脂蜜、花蝴蝶、西施）盆栽苗放置于光照培养箱中进行干旱胁迫处理，光照培养箱设置条件为温度25 ℃，每天光照12 h;干旱处理为先给盆栽苗浇清水至饱和，以后不再浇水，以12 d为1个处理周期。分别在进行干旱胁迫0、3、6、9、12 d进行叶片样品收集制备，以0 d取的样品作为对照。
　　取相同位置上杜鹃成熟功能叶片，避开主脉，在中脉至叶边缘1/2处取约1 mm×1 mm大小的叶片小块，迅速投入到2.5%戊二醛固定液中，抽气30 min，使叶片全部浸泡在固定液中，室温放置2 h，置于4 ℃冰箱保存，制备常规透射电镜样品，每个品种每次取样50个重复。
　　2  结果与分析
　　2.1  干旱胁迫对杜鹃叶肉细胞整体形态的影响
　　干旱胁迫条件下，杜鹃的细胞整体形态都受到了不同程度的影响（圖1）。干旱胁迫0 d（图1a、图1f、图1k），3个品种的细胞总体形态无较大差异，细胞形态规则，细胞器均沿细胞壁分布，细胞膜完整，胞间连丝清晰可见。胭脂蜜进行干旱胁迫6 d内（图1a、图1b、图1c），细胞形态未发生较大变化，9 d（图1d）时细胞整体形态开始变形，细胞器有向细胞中心移动的趋势，细胞膜仍完整，但已出现质壁分离的现象，12 d（图1e）时细胞质壁分离严重，且细胞膜已破裂，细胞器散落于细胞中央，细胞壁仍保持完整。花蝴蝶干旱胁迫3 d（图1g），细胞依然紧密排列，6 d（图1h）时已开始变形，形态较扭曲，出现质壁分离，细胞器趋向细胞中央移动，干旱胁迫9 d（图1i）时出现严重的质壁分离，细胞膜破裂但细胞壁完整，12 d（图1j）时细胞壁已破碎，整个细胞解体，细胞器外流出细胞。西施在整个干旱过程中都观察到较大的淀粉粒（图1k至图1o），干旱胁迫3 d（图1l）细胞开始变形，部分细胞出现轻微的质壁分离，细胞器趋向于向细胞中央移动，6 d（图1m）时出现严重的质壁分离现象，部分细胞细胞膜已破裂，细胞器散落于细胞中央，细胞壁外部出现不规则或泡状的膨胀，干旱胁迫9 d（图1n）细胞膜完全破裂，细胞器聚集于一起偏离中央位置而靠于细胞壁一侧，细胞壁仍保持完整，12 d（图1o）时细胞器相互粘连，基本连成一片，难以区别辨认，细胞壁破裂，细胞内含物向外流出。
　　2.2  干旱胁迫对杜鹃叶绿体结构的影响
　　干旱胁迫条件下，杜鹃的叶绿体组织结构受到了不同程度的影响（图2）。叶绿体的形状发生改变，由原来的梭形或长椭圆形膨胀呈近球形或不规则形状，在严重的干旱胁迫情况下产生破碎。随着干旱胁迫加深，各品种杜鹃叶片叶绿体均由原先的紧贴细胞壁排列，逐渐向细胞中央移动。干旱胁迫0 d，3个品种的叶绿体总体形态无较大差异（图2a、图2f、图2k），其中胭脂蜜（图2a）叶绿体周围有类似晶体的物质，晶体长条状，形态规则，紧贴叶绿体分布。干旱胁迫3 d，胭脂蜜叶绿体形态无较大变化，花蝴蝶（图2g）与西施（图2l）叶绿体不再紧贴细胞壁，且叶绿体外膜变得模糊，基粒片层较胭脂蜜（图2b）紊乱，出现少量嗜锇颗粒。6 d时胭脂蜜（图2c）仍能观察到完整的叶绿体结构与清晰的片层结构，同样出现少许嗜锇颗粒，类晶体的物质形态变得模糊、杂乱;花蝴蝶（图2h）叶绿体外膜破裂，形态膨胀;西施（图2m）叶绿体外膜仍完整，形态膨胀呈长椭圆形，已观察不到片层结构，嗜锇颗粒增多。干旱胁迫9 d，胭脂蜜（图2d）叶绿体外膜变模糊，整体形态膨胀，嗜锇颗粒聚集，类晶体物质依然紧贴在叶绿体附近，但已形态模糊;花蝴蝶（图2i）叶绿体边缘已破裂，膨胀呈近圆形;西施（图2n）叶绿体外膜仍可观察到，未完全破裂，进一步膨胀，嗜锇颗粒聚集。干旱胁迫12 d，胭脂蜜（图2e）叶绿体膜破裂，整体膨胀，类晶体物质仍在叶绿体周围散乱分布，但形态已完全无法辨认;花蝴蝶（图2j）叶绿体膨胀呈圆形，叶绿体膜已完全解体，边缘破碎不规则;西施（图2o）叶绿体膨胀呈不规则状，内部结构混乱，出现空腔的现象。
　　2.3  干旱胁迫对杜鹃线粒体结构的影响
　　在干旱胁迫条件下，线粒体结构随干旱胁迫时间的增加而受到不同程度的影响（图3）。进行干旱胁迫0 d，3个品种的线粒体（图3a、图3f、图3k）结构无较大差异，多为圆形或类圆形，具有双层膜，膜结构完整，能明显观察到线粒体内部的嵴。干旱胁迫3～6 d（图3b、图3c、图3g、图3h、图3l、图3m），各品种的线粒体变化基本相同，形态未发生较大改变，外膜清楚，但内膜结构开始模糊，可以观察到部分嵴。胭脂蜜干旱胁迫9 d（图3d）外膜开始变模糊，内部出现空洞，12 d（图3e）时，部分线粒体保持完整，部分线粒体膜破裂，内部物质向外流出，出现空洞。花蝴蝶干旱胁迫9 d（图3i）线粒体内部降解，外膜也破碎，轮廓模糊不清，12 d（图3j）时在细胞中散落较多碎片，线粒体已无法辨认。西施中线粒体干旱胁迫9 d（图3n）发生变形，内部结构模糊，外膜还未完全破裂，12 d（图3o）时在细胞内部只能观察到形似线粒体物质，已无外膜包裹，内部模糊不清，难以辨别。
　　3  小结与讨论
　　随着干旱胁迫程度的加重，3个杜鹃品种的叶肉细胞超微结构都受到不同程度的影响。胭脂蜜在整个干旱胁迫过程中，质壁分离现象出现时间较其余两个品种晚，其细胞膜受伤害程度在相同的处理时间明显低于花蝴蝶和西施，且细胞壁至胁迫处理结束依然保持完整，而花蝴蝶与西施细胞壁都已破裂，导致干旱胁迫后期细胞器外流出细胞。这些细胞超微结构变化与植株外观形态表现一致，胭脂蜜在受到干旱胁迫时能够较长时间维持细胞的完整性，具有更强的抗旱性。 　　植物在干旱胁迫下，叶片细胞的超微结构会发生明显的变化。干旱胁迫能诱导植物叶片过量产生超氧阴离子自由基和过氧化氢之类的活性氧，破坏了活性氧代谢系统的平衡，活性氧水平增高，从而发生脂膜过氧化和膜蛋白的聚合作用，从而损伤植物的超微结构[1，2]。在本研究中杜鹃叶片超微结构干旱胁迫3 d开始有轻微损伤，主要的细胞器叶绿体与线粒体随着干旱胁迫程度的加重受到不可逆的伤害，胭脂蜜的叶绿体结构能更长时间保持完整，受伤害程度在相同时间内明显低于其余两个品种。线粒体受伤害程度在3个品种中都表现出前期变化不明显，而在干旱后期，花蝴蝶线粒体首先失去完整结构，在细胞器中已无法辨认，其次是西施，但线粒体未观测到破裂，而胭脂蜜有线粒体已经破裂。由此可知，在同一品种中相同的干旱胁迫情况下，叶绿体比线粒体对干旱更为敏感，线粒体比叶绿体更长时间维持完整性。
　　从研究结果可知，在未进行干旱胁迫时，3種杜鹃的叶绿体和线粒体结构无较大差异，都呈梭形或长椭圆形，紧贴细胞壁排列，随着干旱胁迫时间的增加，叶绿体呈现向细胞中央移动的趋势，并膨胀为球形或不规则形;线粒体未受到干旱影响时，多为圆形或类圆形，具有双层膜，膜结构完整，受到干旱胁迫后，线粒体膜破裂，内部物质向外流出，出现空洞。从时间上讲，叶绿体受到干旱胁迫影响比线粒体出现早，这说明杜鹃叶肉细胞的叶绿体对水分亏缺的敏感高于线粒体，这与禾草的表现一致[2，3]。叶绿体在光合作用过程中会产生一些活性氧物质，在受到干旱胁迫后，杜鹃体内产生的大量活性氧物质不能被及时清除，自由基产生和清除平衡遭到破坏，自由基首先攻击膜系统，造成膜脂过氧化产物含量的增加，表现为MDA含量的增加，随着干旱加重，叶绿体系统受损也会加重，但是不同抗旱能力的植物在相同干旱条件下，叶绿体的受损程度也会不同[4，5]。在本研究中，耐旱的胭脂蜜干旱胁迫6 d才出现明显的受损现象，而西施和花蝴蝶干旱胁迫3 d已经表现出较明显的受损。由此，可以用叶绿体结构受损程度反映其抗旱能力。水分胁迫首先是破坏膜的透性，线粒体受到损伤也是从膜开始，嵴也受到不同程度的影响。前人的研究中[6，7]，干旱胁迫对线粒体的伤害晚于叶绿体，本研究中发现也是如此，这可能是因为线粒体是呼吸作用的主要场所，是为植物的生命活动提供能量，在受到干旱胁迫后，对抗干旱的过程中依然需要能量的供应。
　　参考文献：
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