超声波法提取黄皮叶中黄酮工艺的优化

来源:用户上传      作者: 周燕芳

　　摘要：使用超声波法提取黄皮（Ｃｌａｕｓｅｎａ ｌａｎｓｉｕｍ）叶中的黄酮，并用单因素试验和正交设计优化提取工艺。结果显示与浸提法相比，超声波法能提高黄酮的提取率、缩短处理时间。橄榄黄皮叶中黄酮的提取率高于鸡心黄皮和黑皮黄皮。优化的黄皮叶黄酮提取条件为乙醇体积分数８０％、提取温度４０ ℃、超声处理时间４０ ｍｉｎ、料液比１∶６０（m∶V，g/mL），此条件下黄皮叶中黄酮提取率为３．６２％。
　　关键词：黄皮（Ｃｌａｕｓｅｎａ ｌａｎｓｉｕｍ）叶；黄酮；超声波法；提取
　　中图分类号：Ｒ２８４．２；Ｓ６６６．６ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）07－1433-03
　　
　　Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ－ａｓｓｉｓｔｅｄ Method ｏｆ Ｆｌａｖｏｎｏｉｄ ｆｒｏｍ Ｌｅａｆ of Ｃｌａｕｓｅｎａ ｌａｎｓｉｕｍ
　　
　　ＺＨＯＵ Ｙａｎ－ｆａｎｇ
　　（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｐａｒｍｅｎｔ， Ｈａｎｓｈａｎ Ｔｅａｃｈｅｒｓ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｃｈａｏｚｈｏｕ ５２１０４１， Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ， Ｃｈｉｎａ）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ａｄｏｐｔｅｄ ｔｏ ｅｘｔｒａｃｔ ｆｌａｖｏｎｏｉｄ ｆｒｏｍ ｌｅａｆ ｏｆ Ｃｌａｕｓｅｎａ ｌａｎｓｉｕｍ， ａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｒａｆｔ ｗａｓ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ ｔｅｓｔｓ ａｎｄ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｌｉｘｉｖｉａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ， ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ-ａｓｓｉｓｔｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｒ ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｗａｓ ｍｕｃｈ ｓｈｏｒｔｅｒ． Ｔｈｅ Ｃ． ｌａｎｓｉｕｍ ｃｕｌｔｉｖａｒ ｗｉｔｈ ｏｌｉｖｅ ｌｅａｆ ｈａｄ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｆｌａｖｏｎｏｉｄ ｙｉｅｌｄ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｔｅｓｔｅｄ ｃｕｌｔｉｖａｒs． Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ， ｔｈｅ optimum ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｆｌａｖｏｎｏｉｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｌｅａｆ ｏｆ Ｃ． ｌａｎｓｉｕｍ ｗａｓ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ， ｖｏｌｕｍｅ fraction ｏｆ ｅｔｈａｎｏｌ， ８０％； Eｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ４０ ℃； Uｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｔｉｍｅ， ４０ ｍｉｎ； Sｏｌｉｄ ｔｏ ｌｉｑｕｉｄ ｒａｔｉｏ， １∶６０（m∶V，g/mL）； Aｎｄ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｆｌａｖｏｎｏｉｄ was ３．６２％ under this condition．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｌｅａｆ ｏｆ Ｃｌａｕｓｅｎａ ｌａｎｓｉｕｍ； ｆｌａｖｏｎｏｉｄ； ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｍｅｔｈｏｄ； ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ
　　
　　黄皮（Ｃｌａｕｓｅｎａ ｌａｎｓｉｕｍ）是芸香科（Ｒｕｔａｃｅａｅ）黄皮属植物，产于我国南部，如福建、广东、台湾、广西、云南等地［１］。民间常将其与所用部位合称，如黄皮果、黄皮核、黄皮子、黄皮叶等。黄皮叶性味属辛、苦、平，《本草求原》中记载黄皮叶有“解秽除垢，退黄肿”之功用。民间用其叶煮水洗浴治疗疥癞、消风肿等。已报道的黄皮化学成分有香豆素类、卡巴唑和酰胺生物碱类、挥发油及萜类、糖分、有机酸、果胶、维生素Ｃ、黄酮碱等。天然来源的生物黄酮分子小，能被人体迅速吸收，通过血脑屏障进入脂肪组织，进而表现出消除疲劳、保护血管、防动脉硬化、扩张毛细血管、疏通微循环、抗脂肪氧化、抗衰老、活化大脑及其他脏器细胞的功能［2］。研究表明，黄皮叶中的黄酮具有显著抑菌效果，且抗过敏活性高，在食品防腐、水果保鲜、医药等领域具有广阔的应用前景［3，4］。本试验从３个黄皮品种的叶中进行黄酮的提取及初步鉴别，以期为黄皮叶的药用价值及其在食品加工中的开发利用提供科学根据。
　　１ 材料与方法
　　１．１ 材料与仪器
　　７２２Ｓ型分光光度计、ＫＱ５００ＤＢ型数控超声波清洗器等；芸香叶苷为生物纯，其他试剂均为分析纯；鸡心黄皮、橄榄黄皮、黑皮黄皮老叶均于２０１１年３月１０日采摘于广东省潮州市潮安县西坑村。
　　１．２ 试验方法
　　１．２．１ 芦丁标准溶液的配制和标准曲线的绘制 按照文献［5］的方法进行芦丁标准溶液的配制和标准曲线的绘制（图１），得到芦丁浓度Ｘ（Ｃ//ｍｇ/ｍＬ）对吸光度Ｙ（Ａ５１０ ｎｍ）的回归方程为Ｙ＝１５．６０７ 0Ｘ－０．１５６ ９，Ｒ２＝０．９９７ ７。
　　１．２．２ 黄皮叶中黄酮的提取 以鸡心、黑皮和橄榄３个品种黄皮叶干燥粉末为原料，分别用浸提法和超声波提取法提取黄酮，提取溶剂为体积分数２０％、４０％、６０％、８０％的乙醇，料液比为１∶１０（ｍ∶Ｖ，ｇ／ｍＬ，下同），浸提温度和时间分别为浸泡提取：室温、２４ ｈ；超声波提取：４０ ℃、３０ ｍｉｎ。测定所得提取液中黄酮的含量，比较两种方法所得黄酮提取率。
　　１．２．３ 单因素试验 根据１．２．２的试验结果，以黄酮提取率最高的品种为原料，设置单因素试验分别考察超声波法的提取温度、超声处理时间和料液比对黄酮提取率的影响。①提取温度。提取条件为料液比１∶１０，超声处理时间２０ ｍｉｎ，体积分数８０％的乙醇为提取溶剂，提取温度分别为３０、４０、５０、６０、７０ ℃。②超声处理时间。提取温度５０ ℃，料液比１∶１０，体积分数８０％的乙醇为提取溶剂，超声处理时间分别为１０、２０、３０、４０、５０ ｍｉｎ。③料液比。超声处理时间２０ ｍｉｎ，体积分数８０％的乙醇为提取溶剂，提取温度为５０ ℃，料液比分别为１∶１０、１∶１５、１∶２０、１∶２５、１∶３０。
　　１．２．４ 正交试验 对影响黄皮叶中黄酮提取的关键因素乙醇体积分数、提取温度、超声处理时间、料液比进行４因素３水平正交试验，因素与水平见表１。
　　
　　２ 结果与分析
　　２．１ 浸提法与超声波提取法的比较
　　用浸提法和超声波法提取３个品种黄皮叶中黄酮，所得结果见表２。由表２可知其他条件相同时，同一黄皮品种中超声波法所得黄酮的提取率高于浸提法，且处理时间大大缩短。相同条件下橄榄黄皮的黄酮提取率比鸡心黄皮和黑皮黄皮的黄酮提取率高，因此后期试验均以橄榄黄皮为材料。
　　由表２还可看出，随着提取溶剂乙醇体积分数的增加，黄酮的提取率也不断升高，试验条件下以体积分数８０％的乙醇为提取剂所得黄酮提取率最高。乙醇体积分数过高，黄皮叶中脂溶性物质的溶出也增加，会给后期的提纯带来困难，因此确定以体积分数８０％的乙醇为提取剂［6］。
　　
　　
　　２．２ 单因素试验结果
　　２．２．１ 提取温度对黄皮叶中黄酮提取率的影响 黄皮叶中黄酮的提取率随着提取温度的升高而逐渐升高（图２），这主要是由于温度升高，溶剂分子的运动比较活跃，对黄酮的提取有利，当温度高于５０ ℃时，溶剂的挥发速度也随着加快，提取率随温度升高而升高的幅度很小［7］，故提取温度以５０ ℃为宜。

　　
　　２．２．２ 超声处理时间对黄皮叶中黄酮提取率的影响 黄酮的提取率先随着超声处理时间的延长而升高，在超声处理时间为３０ ｍｉｎ时达到最高，之后随超声处理时间的延长反而下降（图３）。分析其原因，可能是３０ ｍｉｎ时黄皮叶中的黄酮已经充分溶出，此后再延长处理时间，会导致溶液中的黄酮降解，从而降低了提取率［8］。
　　２．２．３ 料液比对黄皮叶中黄酮提取率的影响 在试验范围内，黄酮的提取率随着料液比减小而升高（图４），可见提取溶剂用量增加，可使更多的黄酮溶于溶液中，但提取剂用量也不宜过高，否则会导致产物中杂质增多，并给后期产物的收集和纯化带来不便［9］。
　　
　　
　　２．３ 正交试验结果
　　由表３可知，各因素对黄皮叶中黄酮提取效果影响的大小顺序是乙醇体积分数、料液比、超声处理时间、提取温度。黄皮叶黄酮的最佳提取条件为Ａ１Ｂ３Ｃ３Ｄ３，即提取温度４０ ℃、超声处理时间４０ ｍｉｎ、体积分数８０％的乙醇为提取剂、料液比为１∶６０，在此条件下黄酮的提取率为３．６２％，高于其他试验组合。
　　２．４ 回收率试验结果
　　采用加标回收法［10］，取３份最优条件下的提取液各１ ｍＬ，分别置于２５ ｍＬ的比色管中，再分别加入０．２、０．３、０．４ ｍＬ浓度为０．２ ｍｇ／ｍＬ的芦丁标准液，测定Ａ５１０ ｎｍ，计算总黄酮含量，结果见表４。样品的平均回收率为９９．８４％，ＲＳＤ为３．５２％，表明本法具有良好的回收率。
　　３ 结论
　　１）与传统醇提取法相比，超声波提取法大大缩短了提取时间，且黄酮的提取率也有所提高。
　　２）橄榄黄皮叶中黄酮的含量高于鸡心黄皮和黑皮黄皮叶中黄酮的含量。
　　３）根据单因素试验和正交试验结果，各因素对橄榄黄皮叶中黄酮提取效果影响的大小顺序是：乙醇体积分数、料液比、超声处理时间、提取温度。橄榄黄皮叶中黄酮的最佳提取条件为提取温度４０ ℃、超声处理时间４０ ｍｉｎ、体积分数为８０％的乙醇做提取溶剂、料液比为１∶６０。
　　４）加标回收法测定结果表明，试验具有良好的回收率，黄酮的平均回收率为９９．８４％。
　　参考文献：
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　　［2］ 陈 化，吴迎椿． 超声波提取小叶榕总黄酮及鉴别［Ｊ］． 时珍国医国药，２００８，１９（７）：１６７７－１６７８．
　　［３］ 赵丰丽，杨健秀，梁燕美，等． 黄皮叶乙醇提取物化学成分预实验及对植物病原菌的抑制作用［Ｊ］． 食品科技，２００９（１）：１９５－１９９．
　　［4］ 赵丰丽，李洁荣，杨健秀． 黄皮叶不同溶剂提取物抗过敏活性研究［Ｊ］． 食品工业科技，２００９（１）：１１０－１１２．
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