盐酸小檗碱纳米胶束的制备、表征及体外抗肿瘤活性的研究

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　　[摘要] 以聚乙二醇维生素E琥珀酸酯（TPGS）为载体材料，以盐酸小檗碱为模型药物，采用薄膜水化法构建盐酸小檗碱（berberine hydrochloride，BER）纳米胶束（BER-PMs），以改善其溶解性和体外抗肿瘤效果。分别采用透射电子显微镜观察纳米胶束的形态；粒度测定仪考察其粒径和Zeta电位；超速离心法考察载药胶束的包封率和载药量；动态膜透析法测定载药胶束的体外释药特性；四甲基偶氮唑盐（MTT）法研究其对人乳腺癌细胞（MCF-7）的抑制作用。结果表明，所制备的BER-PMs平均粒径为（12.45±1.46） nm；粒径均一且呈球形；载药量和包封率分别为（5.7±0.22）%，（95.67±5.35）%；Zeta电位为（-1.12±0.23） mV；在体外pH 7.4，6.5的磷酸盐缓冲液中，24 h内分别释放37.20%，41.14%；同时与BER相比，BER-PMs能更显著地抑制MCF-7细胞的增殖（P<0.05）、促进细胞的凋亡，提高BER的体外抗肿瘤活性。因此，所构建的盐酸小檗碱胶束能更有效地促进MCF-7细胞的凋亡，提高药物的体外抗肿瘤效果。
　　[关键词] 盐酸小檗碱；纳米胶束；聚乙二醇维生素E琥珀酸酯；抗肿瘤；细胞凋亡
　　[Abstract] With polyethylene glycol vitamin E succinate （TPGS） as the carrier materials， and berberine hydrochloride （BER） as model drug， we formed berberine hydrochloride （BER）-loaded TPGS nanomicells （BER-PMs） using filming-rehydration method to improve its solubility and in vitro anti-tumor effect. The transmission electron microscope （TEM） was used to observe the particle appearance； particle detector was used to detect the diameter and Zeta potential； and ultracentrifugation was utilized to determine the encapsulation efficiency （EE） and drug-loading （DD）； dynamic dialysis method was used to study the in vitro release behavior of BER-PMs， and the anti-tumor activity against MCF-7 cells was determined by MTT method. Results showed that the average particle size of BER-PMs was （12.45±1.46） nm； particle size was uniform and spherical； drug loading and encapsulation efficiency were （5.7±0.22）% and （95.67±5.35）%， respectively. Zeta potential was （-1.12±0.23） mV； release rate within 24 h was 37.20% and 41.14% respectively in pH 7.4 and pH 6.5 phosphate buffer in vitro； compared with BER， BER-PMs can significantly inhibit MCF-7 cell proliferation （P<0.05）， promote cell apoptosis and improve the anti-tumor activity of BER in vitro. Therefore， the formed berberine hydrochloride micelle can more effectively promote the apoptosis of MCF-7 cell， and improve the drug′s in vitro anti-tumor effect.
　　[Key words] berberine hydrochloride； nano micelle； polyethylene glycol vitamin E succinate； anti-tumor； cell apoptosis
　　doi：10.4268/cjcmm20152112
　　盐酸小檗碱（berberine hydrochloride， BER）又名黄连素，是毛莨科黄连属植物黄连等植物中的有效成分，在自然界中多以季铵盐的形式存在，传统功效为清热解毒，临床上常用于治疗胃肠道感染与腹泻。现代药理学研究表明，盐酸小檗碱对消化系统、心血管系统、中枢神经系统、炎症、糖尿病、肿瘤等均有一定的治疗效果，显示出广阔的应用前景[1-6]。
　　近年来研究表明，小檗碱可以通过抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞转移等机制而发挥抗肿瘤作用[7-10]。但是其自身的理化性质（如较低的溶解性和较差的膜渗透性）以及肿瘤的多药耐药性，严重限制了盐酸小檗碱的体内抗肿瘤效果。目前，为了增加其溶解性、克服肿瘤多药耐药，进而增强其抗肿瘤效果，涌现出了许多小檗碱新剂型，主要包括脂质体、微球和微乳等[11-14]。但小檗碱聚合物胶束尚未有研究报道。聚合物胶束由两亲性共聚物在水性介质中自组装形成的核壳结构纳米给药系统。胶束不仅能显著地提高药物的溶解性，一定程度上逆转肿瘤多药耐药，同时能通过增加渗透与滞留时间（enhanced permeability and retention time， EPR效应）而深部渗透到肿瘤部位而提高药物的抗肿瘤效果。因而，本课题以具有P-gp抑制作用的聚乙二醇维生素E琥珀酸酯（TPGS）为纳米材料，以盐酸小檗碱（BER）为模型药物，制备盐酸小檗碱-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯纳米胶束（BER-PMs），对胶束的制剂学性质体外抗肿瘤效果进行考察，以期为小檗碱纳米胶束的研究奠定基础。 　　1 材料
　　Agilent 1260高效液相色谱仪（包括四元泵，自动进样器，DAD二极管阵列检测器）；1/10万METTLERAL204 电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；旋转蒸发仪（瑞士步琪公司）；Multiskan GO全波长扫描酶标仪（美国Thermo公司）；Eppendorf高速离心机（德国艾本德生物有限公司）；Nano-ZS型粒度测定仪（英国Malvern公司）；H-600型透射电镜（日本Hitachi公司）。
　　聚乙二醇维生素E琥珀酸酯（TPGS），美国Sigma公司；盐酸小檗碱对照品，批号110713-201212，纯度>98%，中国食品药品检定研究院；小檗碱原料药，纯度>98%，批号20120806，南京泽郎医药科技有限公司；人乳腺癌细胞系（MCF-7细胞），南京凯基生物技术有限公司；细胞凋亡试剂盒，南京诺唯赞生物科技有限公司；聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯（吐温80），天津光复精油化工研究所；胎牛血清、胰蛋白酶、1640培养液、磷酸盐缓冲液（PBS）均购自美国Hyclone公司；透析袋，美国Viskase公司，截留相对分子质量为14 000；所用有机溶剂均为分析纯。
　　2 方法与结果
　　2.1 纳米胶束的制备
　　采用薄膜水化法制备盐酸小檗碱纳米胶束，具体制备过程如下：精密称取TPGS 100 mg，溶解于4 mL甲醇溶液，然后加入不同体积的盐酸小檗碱的甲醇溶液（1 g・L-1），充分混匀后，旋转蒸发除去有机溶剂。加入4 mL pH 7.4的PBS缓冲溶液，于37 ℃磁力搅拌4 h，12 000 r・min-1离心10 min，上清液即为澄清透明的盐酸小檗碱纳米胶束溶液。
　　2.2 液相方法的建立
　　2.2.1 色谱条件 色谱柱为C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.5%磷酸水溶液（25∶75，三乙胺调pH至4.0）；流速1.0 mL・min-1；柱温25 ℃；检测波长275 nm；进样量10 μL。
　　2.2.2 方法专属性 分别量取适量盐酸小檗碱对照品、盐酸小檗碱胶束溶液和空白纳米胶束溶液，加入10倍体积的甲醇稀释，超声（200 W，40 kHz）10 min破乳，0.22 μm微孔滤膜滤过，取滤液，按2.2.1项下色谱条件进样测定。结果表明，盐酸小檗碱色谱峰峰形良好，辅料和溶剂对药物测定无干扰，见图1。
　　2.2.3 线性范围考察 精密称取盐酸小檗碱对照品10 mg，置于10 mL棕色量瓶中，甲醇溶解、稀释至刻度，配制成质量浓度为1 g・L-1的盐酸小檗碱对照品储备液。分别精密量取盐酸小檗碱对照品储备液适量，甲醇稀释成质量浓度分别为100.0，50.0，20.0，10.0，5.0，2.0，1.0 mg・L-1的系列对照品溶液，按2.2.1项下色谱条件进样测定，以峰面积积分值（Y）对质量浓度（X）进行线性回归，得盐酸小檗碱回归方程Y=27.564X+19.626 8，R2=0.999 9，结果表明盐酸小檗碱在1～100 g・L-1线性关系良好。
　　2.2.4 加样回收率考察 量取1 mL空白胶束溶液于10 mL棕色量瓶中，分别精密加入盐酸小檗碱对照品适量，用甲醇稀释至刻度，配成低、中、高（1，10，100 mg・L-1）3个质量浓度的样品溶液。经0.22 μm微孔滤膜滤过，取滤液按2.2.1项下色谱条件进样测定，计算得平均回收率分别为（97.25±4.57）%，（102.12±0.35）%，（98.70±0.09）%（n=3），符合方法学要求。
　　2.2.5 精密度考察 取低、中、高（1.0，10.0，100.0 mg・L-1）3个质量浓度的盐酸小檗碱对照品溶液，按2.2.1项下色谱条件进样测定，分别于1 d内测定6次，连续测定3 d，计算得日内和日间精密度的RSD分别为1.4%，1.7%，1.1%和7.0%，2.0%，1.2%，符合方法学要求。
　　2.2.6 稳定性考察 取同一批次制备的BER-PMs溶液，加入10倍体积的甲醇溶液稀释，超声，0.22 μm微孔滤膜滤过，取滤液分别于0，2，4，8，6，12，24 h按2.2.1项下色谱条件进样测定，结果RSD 0.28%，符合方法学要求。
　　2.2.7 重复性考察 取同一批次制备的BER-PMs溶液6份，分别加入10倍甲醇溶液稀释，超声，0.22 μm微孔滤膜滤过，取滤液，按2.2.1项下色谱条件进样测定，结果RSD 0.12%，符合方法学要求。
　　2.3 载药胶束的包封率和载药量的测定
　　将制备好的载药胶束经高速冷冻离心机12 000 r・min-1离心（4 ℃）10 min，除去游离药物，上清液即为载药胶束。分别量取一定体积离心前、后的胶束溶液，加入10倍体积甲醇溶解、超声破坏纳米胶束的结构，测定离心前、后胶束中药物的含量，计算包封率。同时将一定体积离心后的胶束溶液冷冻干燥，称重并甲醇溶解测定所含药物量，计算载药量。
　　包封率（EE）=胶束中药量/药物总质量×100%
　　载药量（DL）=冻干胶束中药物量/冻干胶束的质量×100%
　　2.4 纳米胶束的处方优化
　　药物与材料的比例对纳米胶束的粒径及包封率的影响较大[15]，因此，以包封率、粒径和载药量为指标，考察了不同材料与药物比例对纳米胶束的影响。结果见表1，在载体量相同的条件下，随着药物含量的增加，载药量增加；当药物含量分别为4，5，6 mg时，载药胶束均具有较高的包封率（>95%）；但当药物含量为8，10 mg时，载药胶束的包封率下降，分析可能是因为疏水内核中的药物含量达到了饱和，因而增加药物的含量而包封率下降。而稳定性是纳米胶束体内外发挥药效的重要条件，为了确定处方中药物与材料的比例，考察了不同载药胶束的贮存稳定性，结果见图2。当药物含量为4，5，6 mg时，4 ℃放置21 d，胶束仍然澄清透明，药物含量几乎没有变化；但当药物含量增至8，10 mg时，放置7 d便出现絮状沉淀，含量显著下降。综合考虑包封率、载药量和稳定性的结果，最终确定载体与药物的比例为100∶6。 　　因此，确定纳米胶束的处方及制备工艺为100 mg TPGS溶于适量甲醇溶液，待完全溶解后加入1 g・L-1的盐酸小檗碱甲醇溶液6 mL，混匀后，旋转蒸发除去有机溶剂。加入4 mL PBS，37 ℃磁力搅拌4 h，12 000 r・min-1离心（4 ℃）10 min，取上清液即为盐酸小檗碱纳米胶束。所制备载药胶束的平均粒径为（12.45±1.46）nm；载药量和包封率分别为（5.7±0.22）%，（95.67±5.35）%，Zeta电位为（-1.12±0.23）mV。
　　2.5 形态、粒径和Zeta 电位
　　取适量BER-PMs溶液，蒸馏水稀释，Nano-ZS型粒径分析仪测定平均粒径及Zeta电位。将BER-PMs滴至覆有支持膜的铜网上，用1%乙酸双氧铀染色剂染色，用滤纸吸走多余的液体，自然晾干后，TEM观察其形态。所制备纳米胶束表面呈负电荷，粒径均一，呈球形。见图3，4。
　　2.6 体外释放考察
　　分别取1 g・L-1的盐酸小檗碱胶束溶液及盐酸小檗碱原料药溶液1 mL放入到预先处理好的透析袋中，并将透析袋置于50 mL释放介质中（即pH 6.5和pH 7.4 PBS缓冲液，含0.5%吐温80），于（37±0.5）℃恒温水浴振荡（100 r・min-1），分别于0.5，1，2，4，6，8，10，12，24 h取样1 mL，并补充同温等量释放介质。样品用0.22 μm微孔滤膜滤过，取滤液按2.1.1项下色谱条件进样测定，计算累积释放率，并绘制释药曲线。见图5。
　　盐酸小檗碱溶液在2种pH条件下4 h几乎全部释放，释放量达98%以上，表明透析袋对药物没有截留作用。而载药胶束在pH 7.4生理条件下释放缓慢只有32%，表明胶束在生理条件下稳定性较好，药物主要包裹于胶束疏水内核中，以胶束的形式存在。载药胶束在pH 6.5条件下药物释放41%，虽然较pH 7.4释放较快，但是释放量仍然很少，表明纳米胶束在到达肿瘤位点之前，在血液循环中能保持完整的胶束结构而较少的释放药物，从而表明所制备的载药胶束稳定性良好。
　　2.7 体外抗肿瘤活性研究
　　将状态良好的MCF-7细胞以5×104个/mL细胞密度，每孔细胞悬液100 μL加至96孔板中，置培养箱中孵育24 h，待细胞贴壁后加药。分别加入100 μL质量浓度分别为2，5，10，20，50，100 mg・L-1的盐酸小檗碱溶液和载药胶束溶液以及处方比例的小檗碱与载体材料的物理混合和相应浓度的载体材料（均用含胎牛血清的1640培养液配制），每个浓度3个平行孔，以空白1640培养液为对照组。分别于加药后24，48，72 h，将96孔板取出，每孔加入2 g・L-1 MTT溶液50 μL，置培养箱中孵育4 h后甩板，将96孔板倒扣于滤纸上充分吸干残留液体后，每孔加入200 μL DMSO于振荡器上振荡10 min溶解蓝紫色结晶物。使用酶标仪在570 nm处测定各孔调零后的吸光度，并计算细胞的存活率。
　　BER-PMs，BER，BER+TPGS及TPGS的体外细胞抑制实验结果见图6，从结果中可以看出，TPGS，BER，BER+TPGS和BER-PMs对肿瘤细胞均具有一定的抑制作用，并呈浓度与时间依赖性。从图6中可以看出，盐酸小檗碱在2～100 mg・L-1 24 h时BER存活率从98.16%下降至45.10%，而BER-PMs的存活率从96.11%下降至41.76%；48 h时BER的存活率从95.83%降至44.15%，而BER-PMs的存活率从88.84%降至36.55%；72 h时BER存活率从90.62%降至38.52%，BER-PMs存活率从86.17%降至29.53%。而TPGS+BER的细胞毒性介于BER及BER-PMs之间，表明载体材料具有一定的细胞毒性，但是制剂的细胞毒性高于药物与材料的物理混合。同时应用GraphPad prism 5.0软件拟合数据计算BER-PMs组、BER+TPGS和BER组对MCF-7细胞的半数抑制浓度（IC50）见表2。综上可以看出在同一时间点各组药物对MCF-7细胞的IC50大小顺序为BER> BER+TPGS> BER-PMs，表明盐酸小檗碱包裹于胶束中，能显著提高其抗肿瘤效果。
　　BER-PMs能显著提高BER体外抗肿瘤活性，主要是因为：①胶束的粒径较小，能通过EPR效应而靶向到肿瘤部位；②BER被包载于胶束的疏水性内核中，增加了药物的水溶性，能更好的发挥药效；③PEG形成的亲水性外壳具有隐形性，能减少药物酶解，能避免调理素等蛋白吸附而避免被网状内皮系统的吞噬，延长药物的血液循环时间，达到长循环效果[17]；④TPGS具有P-gp抑制作用，在一定程度上抑制了P-gp对小檗碱的外排，逆转了肿瘤多药耐药；⑤材料本身具有一定的抗肿瘤作用。
　　2.8 细胞凋亡试验
　　采用Aimexin V-FITC/PI双染法检测BER溶液和BER-PMs对MCF-7细胞凋亡的影响。取处于对数生长期的MCF-7细胞，以1×105细胞/孔/1 mL接种于24孔板上；置培养箱（37 ℃，5% CO2）中孵育，24 h待细胞贴壁后，弃去旧的培养基，分别加入20 mg・L-1的BER 溶液和BER-PMs（药物的配制均用含胎牛血清的1640培养液）孵育48 h，48 h后将药物溶液吸走，用预冷的PBS缓冲溶液洗涤细胞3次，每孔加入胰酶消化细胞，待消化完成后加入含20%胎牛血清的PBS缓冲液中和，离心收集细胞。加入100 μL 1×Binding Buffer，5 μL Annexin和5 μL PI Staining Solution，轻轻混匀，避光，室温反应10 min。采用流式细胞仪进行测定。 　　以右上象限（凋亡晚期）及右下象限（调亡早期）中细胞所占比率之和计算细胞调亡率。实验结果见图7，表明载药胶束的凋亡率较药物溶液显著提高，而盐酸小檗碱包载于胶束中能更好地诱导细胞凋亡。
　　3 讨论
　　近年来，研究发现盐酸小檗碱可以通过调控细胞周期而抑制肿瘤细胞增殖，还可以通过断裂DNA而诱导肿瘤细胞凋亡[16]，在肿瘤治疗中有着广阔的发展前景。但是其属于BCSⅢ类药物，水溶性及膜渗透性均较差，限制了它的药效与应用。本研究以TPGS为载体，构建了盐酸小檗碱纳米胶束，所制备纳米胶束粒径较小，粒径均一呈球形；具有较高的包封率和载药量且体外释放缓慢。MTT及细胞凋亡实验结果均表明，与盐酸小檗碱溶液相比，载药胶束具有更好地体外抗肿瘤效果。因而，本研究为盐酸小檗碱在抗肿瘤中的应用提供了新的思路。
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　　[责任编辑 孔晶晶]
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