翡翠贻贝酶解液体外降压活性评价方法研究

来源:用户上传      作者:安婷婷 王鹤 邓长春 林资政

　　摘要 [目的]研究翡翠貽贝酶解液的体外降压活性，为后期开发药品和保健食品等提供前期的理论和试验基础。[方法]采用反向高效液相色谱法检测翡翠贻贝酶解液的体外降压活性。色谱柱：YMC C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相：A为0.1%TFA乙腈，B为0.1%TFA水;测定波长228 nm;流速1 mL/min;进样量20 μL。[结果]该方法使翡翠贻贝降血压肽、HHL和马尿酸较好地分离，在0.02～0.20 mg/mL线性关系良好（R2= 0.997 2），最低检出限为50 ng，定量限为200 ng，平均回收率为101.87%。[结论]该方法简便、快速、灵敏度高，可用于评价翡翠贻贝降血压肽的体外活性。
　　关键词 翡翠贻贝酶解液;反相高效液相色谱法;体外;降压活性
　　中图分类号 TQ914.2文献标识码 A文章编号 0517-6611（2020）07-0219-02
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.07.062
　　Study on the Method for Evaluating the Antihypertensive Activity of the Enzymatic Hydrolysate of Perna viridis in vitro
　　AN Tingting，WANG He，DENG Changchun et al
　　（Pharmaceutical Institute of Hainan Province，Haikou，Hainan 570311）
　　Abstract [Objective] The research aimed to study the antihypertensive activity of the emerald mussel enzymatic hydrolysate in vitro， and to provide the theoretical and experimental basis for the early development of drugs and health foods.[Method]The RPHPLC method was established for determining the activity of enzymatic hydrolysate of Perna viridis in vitro.It was analyzed by HPLC on a YMC C18 colunm（250 mm×4.6 mm，5 μm） and detected at the wavelength of 228 nm;mobile phase： A was 0.1% TFA acetonitrile， B was 0.1% TFA water;the velocity of flow was 1.0 mL/min and sample size was 20 μL.[Result]This method could separate the enzymatic hydrolysate of Perna viridis，HHL and hippuric acid well. There was perfect linear correlation between 0.02-0.20 mg/mL（R2= 0.997 2）. The detection limit was 50 ng and the limit of quantitation was 200 ng.The average recovery rate was 101.87%.[Conclusion]The method is simple， rapid and sensitive. It can be used to evaluate the enzymatic hydrolysate of Perna viridis activity in vitro. 　　Key words Enzymatic hydrolysate of Perna viridis;RPHPLC method;in vitro;Antihypertensive activity
　　基金项目 海南自然科学基金面上项目（817201）。
　　作者简介 安婷婷（1982—），女，河北新乐人，高级工程师，硕士，从事新药研发、质量标准建立、海洋药物方面研究。
　　收稿日期 2019-10-12
　　高血压是一种危险的多发病，同时它又是动脉硬化、冠心病、心脏及肾脏功能衰竭的最主要的致病因素，全球患高血压人数已超过5 亿。目前，普遍采用治疗高血压的药物都是化学合成药物，长期服用会产生各种副作用，故医务人员与患者更青睐于非化学合成药物疗法[1-2]。降血压肽又称为血管紧张素转化酶抑制肽（angiotensin converting enzyme inhibitory peptides，简称ACEIPs），其通过抑制血管紧张素转换酶（ACE）的活性，阻碍血管紧张素Ⅱ的生成以及抑制血管舒缓激肽的分解而达到降血压的作用[3]。Je等[4]从发酵贻贝中分离到显著活性的降血压肽。
　　翡翠贻贝（Perna viridis（Linnaeus）），又名绿壳菜蛤、淡菜或青口螺，广泛分布于东海南部和南海，容易人工养殖，繁殖能力很强，产量高。翡翠贻贝肉风味独特，牛磺酸的含量丰富[5]，富含DHA、EPA[6]、糖胺聚糖[7-9]，具有特殊的类似于蚝的香味，中医认为翡翠贻贝性温，能补五脏、理腰脚、益阳事、调经活血，是重要的经济贝类之一。翡翠贻贝酶解液为翡翠贻贝经过一系列酶解产生的、含有大量的降血压肽，该研究主要开发一套适合翡翠贻贝酶解液的体外活性评价方法，为后期开发药品和保健食品等提供前期的理论和试验基础，也为开发海南的經济贝类作出贡献。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 研究对象。翡翠贻贝酶解液，海南省药物研究所自制。
　　1.1.2
　　主要仪器。高效液相色谱仪（岛津，HPLC-2010AHT）;循环水式多用真空泵（SHZ-95）;超声微波清洗仪（SK450HP）;台式高速冷冻离心机（TGL-16MC）。
　　1.1.3
　　主要试剂。马尿酰组胺酰亮氨酸（HHL，SIGMA，美国）;血管紧张素转化酶（ACE，上海源叶生物科技有限公司）;马尿酸（140738-200501，中检所）;乙腈（HPLC级）;三氟乙酸（TFA，HPLC级）;纯化水为海南省药物研究所自制;其他试剂均为国产分析纯。
　　1.2 方法
　　1.2.1 对照品溶液的制备。精密称取马尿酸标准品40 mg，用超纯水稀释，定容至100 mL容量瓶中，配制成0.4 mg/mL马尿酸标准液。
　　1.2.2
　　供试品溶液的制备。80 μL 5 mmol/L HHL与30 μL翡翠贻贝酶解液均匀混合，加入30 μL的0.1 mol/L硼酸盐缓冲液（pH 8.3，含0.3 mol/L NaC1），混匀，加入10 μL 0.1 U/mL ACE溶液，37 ℃下水浴反应35 min，反应完成后加入150 μL 1 mol/L HCl溶液中止反应，离心，为供试品溶液。
　　1.2.3
　　色谱分析条件。色谱柱：YMC C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相：A为0.1%TFA乙腈，B为0.1%TFA水，流动相时间程序如表1所示;检测波长228 nm[10-11];流速1.0 mL/min;进样量20 μL。
　　1.2.4 方法学考察。
　　1.2.4.1
　　系统适应性试验。分别吸取对照品溶液、供试品溶液、5 mmol/L HHL溶液、空白（硼酸盐缓冲液）各20 μL，在“1.2.3”色谱条件下，注入液相色谱仪进行测定，记录色谱图，考察系统适应性。
　　1.2.4.2 线性关系的考察。将马尿酸对照品溶液用纯水稀释制成每1 mL含0.02、0.04、0.06、0.08、1.00、1.20 mg的系列溶液，分别吸取20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，以进样浓度X（mg/mL）为横坐标、峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线，计算线性回归方程。
　　1.2.4.3
　　检测限和定量限的考察。将马尿酸对照品溶液逐步稀释后进样测定，以色谱图中信噪比（S/N）为3时的进样量为最低检测限（LOD），S/N为10时的进样量为最低定量限（LOQ）。
　　1.2.4.4 稳定性试验。取同一供试样品溶液，按“1.2.3”色谱分析条件分别于0、0.5、2.0、4.0、8.0、12.0、24.0 h进样，进样量20 μL，测定峰面积积分值，计算RSD。
　　1.2.4.5 精密度试验。取按“1.2.1”方法制备的马尿酸对照品溶液重复进样6次，计算峰面积的RSD值。
　　1.2.4.6
　　加样回收试验。取同一批次的翡翠贻贝酶解液分为9份，每3份分别加入10、20、30 μL 0.4 mg/mL马尿酸标准溶液，按“1.2.2”方法制备供试品溶液，再按“1.2.3”色谱条件测定，进样量为20 μL，测定峰面积，计算平均回收率和RSD。 　　2 结果与分析
　　2.1 系统适应性试验 图1表明，在“1.2.4.1”条件下，马尿酸的保留时间为15.990 min，HHL出峰保留时间为27.064 min，且在供试品溶液中分离度均大于1.5。由此可见，此色谱条件下能够分离供试品中的各个物质。
　　2.2 线性关系的考察
　　按“1.2.4.2”方法操作，峰面积分别为1 256 896、2 594 000、4 327 563、5 740 945、6 901 320、13 246 812，以进样浓度X（mg/mL）为横坐标、峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线如图2所示，计算得线性回归方程为Y=7E+07X+151 856（R2=0.997 2），表明马尿酸在0.02～0.20 mg/mL呈良好的线性关系。
　　2.3 检测限和定量限的考察 按“1.2.4.3”方法操作，结果表明，马尿酸的检测限和定量限分别为50和200 ng。
　　2.4 稳定性试验 按“1.2.4.4”方法操作，峰面积分别为2 275 842、2 236 815、2 269 853、2 206 398、2 296 442、2 230 150、2 215 963，计算得出平均峰面积为2 247 352，峰面积积分值的RSD为1.5%，表明马尿酸在24 h内比较稳定。
　　2.5 精密度试验 按“1.2.4.5”方法操作，峰面积分别为2 251 855、2 278 469、2 261 029、2 241 584、2 271 489、2 230 369，计算得出平均峰面积为2 255 799，峰面积的RSD为0.81%，表明在此試验条件下精密度良好。
　　2.6 加样回收试验 由表2可见，马尿酸的平均回收率为98.9%，RSD为0.73%，表明该方法准确、可靠，可用于供试品中马尿酸的含量测定。
　　3 结论与讨论
　　该试验建立了一种评价翡翠贻贝酶解液体外活性评价的高效液相色谱方法，此方法在马尿酸为0.02～0.20 mg/mL具有良好的线性关系，平均回收率为98.9%，在24 h内稳定性良好。可见HPLC法方便、准确、快速，可以作为筛选高降压活性的翡翠贻贝酶解液的快速分析方法。此外，在试验过程中，笔者发现已溶解的ACE酶在-20 ℃的条件下极易失活，且价格昂贵，建议实验室自制。笔者研究了加入1 moL/L HCl盐酸终止反应后，加入1.2 mL乙酸乙酯提取后过滤进样，发现回收率仅为50%，故乙酸乙酯提取并不适用于翡翠贻贝酶解液的降压活性评价。
　　参考文献
　　[1] 王茵，刘淑集，吴成业.紫菜降血压肽酶法制备工艺的优化[J].福建水产，2008（4）：64-68.
　　[2] 王茵.紫菜降血压肽的酶法制备及降压效果的研究[D].福州：福建农林大学，2009.
　　[3] 姚成虎，王志耕，梅林，等.胃蛋白酶水解珠蛋白获得ACE抑制肽的工艺优化[J].农业工程学报，2008，24（5）：284-288.
　　[4] JE J Y，PARK P J，BYUN H G，et al.Angiotensin I converting enzyme（ACE）inhibitory peptide derived from the sauce of fermented blue mussel，Mytilus edulis[J].Bioresource technology，2005，96：1624-1629.
　　[5] 章超桦，邓尚贵.天然海鲜调味料生产新工艺：CN96102671.5[P].1997-04-02.
　　[6] 曾远平，刘耘，杨继国.鱼油中 EPA 和 DHA 的富集方法及研究进展[J].现代食品科技，2006，22（1）：160-163.
　　[7] 雷晓凌，吴红棉，范秀萍，等.缢蛏糖胺聚糖的提取分离及其体外抗肿瘤活性的初步研究[J].药物生物技术，2004，11（3）：146-149.
　　[8] 吴红棉，洪鹏志，雷晓凌，等.珠母贝全脏器中糖胺聚糖粗提物的制备及其生理活性初探[J].湛江海洋大学学报，2000，20（3）：50-55.
　　[9] 陈方，吴铁，艾春媚，等.马氏珠母贝全脏器提取物糖胺聚糖抗肿瘤作用的实验研究[J].中国临床药理学与治疗学，2002，7（6）：511-514.
　　[10] MATSUI T，MATSUFUJI H，SEKI E，et al.Inhibition of angiotensin Iconverting enzyme by Bacillus licheniformis alkaline protease hydrolyzates derived from sardine muscle[J].Biosci Biotech Bioch，1993，57（6）：922-925.
　　[11] CUSHMAN D W，CHEUNG H S.Spectrophotometric assay and properties of the angiotensin-converting enzyme of rabbit lung[J].Biochem Pharmaeol，1971，20（7）：1637-1648.
转载注明来源:https://www.xzbu.com/1/view-15189267.htm