多发性骨髓瘤患者骨髓组织中miRNA—181a、miRNA—373的表达及相关性分析

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　　[摘要] 目的 研究多发性骨髓瘤（MM）患者骨髓组织中微小RNA-181a（miRNA-181a）与miRNA-373的表达，探讨其临床意义。 方法 选取2015年3月～2017年3月浙江省台州市第一人民医院收治的67例MM患者作为病例组，选取同期患其他血液疾病的40例患者作为病例对照组、40例健康体检人员作为健康对照组。采用实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测各组骨髓组织中miRNA-181a及miRNA-373的表达，分析各组间两者的表达差异及其与MM临床病理特征的关系。Pearson线性相关分析分析miRNA-181a与miRNA-373表达的相关性。 结果 分别与病例对照组及健康对照组比较，病例组miRNA-181a表达明显较高，miRNA-373表达明显较低（P < 0.05），而病例对照组与健康对照组miRNA-181a、miRNA-373表达差异无统计学意义（P > 0.05）。病例组患者骨髓组织中miRNA-181a、miRNA-373表达与肿瘤分期、肿瘤分化有关（均P < 0.05），其与年龄、性别、细胞学分型及淋巴结转移无关（均P > 0.05）。病例组骨髓组织中miRNA-181a与miRNA-373表达呈明显负相关（r = -0.696，P < 0.05）。病例对照组和健康对照组的miRNA-181a与miRNA-373表达无相关性（r = 0.151、0.179，均P > 0.05）。 结论 MM骨髓组织中miRNA-181a表达升高，而miRNA-373表达降低，两者共同参与肿瘤的发生、发展过程，可能成为新的MM诊断、治疗及预后评估的标志物。
　　[關键词] 多发骨髓瘤；微小RNA-181a；微小RNA-373；相关性
　　[中图分类号] R733.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2019）04（b）-0085-05
　　Expression and correlation analysis of miRNA-181a and miRNA-373 in bone marrow tissue of patients with multiple myeloma
　　WANG Xianting1 ZHENG Liangda1 XIE Jing2 JIANG Wenhua1
　　1.Department of Hematology and Oncology， Taizhou First People′s Hospital， Zhejiang Province， Taizhou 318020， China； 2.Department of Laboratory， Taizhou First People′s Hospital， Zhejiang Province， Taizhou 318020， China
　　[Abstract] Objective To investigate the expression of microRNA-181a （miRNA-181a） and miRNA-373 in bone marrow of patients with multiple myeloma （MM） and to explore its clinical significance. Methods A total of 67 patients with MM who were treated in Taizhou First People′s Hospital from March 2015 to March 2017 were selected as the case group， 40 patients with other blood diseases in the same period were selected as the case control group and 40 healthy people were selected as the healthy control group. Quantitative real-time PCR （qRT-PCR） was used to detect the expression of miRNA-181a and miRNA-373 in bone marrow tissues of each group. The differences in the expression of miRNA-181a and miRNA-373 between these groups and their correlation with clinicopathological features of MM were analysed. Pearson linear correlation analysis were used to show the correlation between miRNA-181a and miRNA-373 expression. Results Compared with the case control group and the healthy control group， the expression of miRNA-181a was significantly higher in the case group and the expression of miRNA-373 was significantly lower （P < 0.05）， but there was no difference in the expression of miRNA-181a and miRNA-373 between the case control group and the healthy control group （P > 0.05）. The expression of miRNA-181a and miRNA-373 in bone marrow tissue of MM patients was related to tumor stage and tumor differentiation （P < 0.05）， but not related to age， gender， cytological type and lymph node metastasis （P > 0.05）. There was a significant negative correlation between miRNA-181a and miRNA-373 expression in the bone marrow of the case group （r = -0.696， P < 0.05）. There was no significant correlation between the case control group and the healthy control group （r = 0.151， 0.179， P > 0.05）. Conclusion The expression of miRNA-181a is increased in MM bone marrow tissue， and the expression of miRNA-373 is decreased. Both of them participate in the tumor development and progression， which may become a new marker for diagnosis， treatment and prognosis of MM. 　　[Key words] Multiple myeloma； MicroRNA-181a； MicroRNA-373； Correlation
　　多发性骨髓瘤（MM）是骨髓微环境中浆细胞的异常克隆增殖和血中高水平的单克隆免疫球蛋白，可造成骨性损害、贫血及肾脏损害，近年来MM发病率有逐渐增高的趋势[1-2]。寻找可靠的MM肿瘤标志物，对于早期诊断、治疗方案选择及病情监测等具有重要意义[3]。微小RNA（miRNA）由18～25个核苷酸组成，研究[4]表明，MM患者骨髓组织中存在多种miRNA表达失调的现象，其参与调控肿瘤细胞的浸润和远处转移。miRNA-181a是miR-181家族构成成员，该家族还包括miRNA-181b、miRNA-181c和miRNA-181d，其可通过靶向多种靶基因来调控肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移和上皮-间质转化过程[5]。miRNA-373位于19q13.42，在多种肿瘤，如卵巢癌、多形胶质母细胞瘤等中均发现miRNA-373具有抑癌基因的功能，其可靶向rab22a等基因，抑制肿瘤细胞侵袭和转移[6]。然而，目前关于miRNA-181a和miRNA-373在MM中的表达及与临床病理特征的关系研究较少。本研究通过检测MM患者骨髓组织中miRNA-181a和miRNA-373表达水平，分析两者表达的相关性，探讨其临床意义。
　　1 资料與方法
　　1.1 一般资料
　　选取2015年3月～2017年3月浙江省台州市第一人民医院（以下简称“我院”）收治的67例MM患者作为病例组，选取同期诊治的40例其他血液疾病患者作为病例对照组、40例骨髓穿刺证实骨髓功能正常的健康人群作为健康对照组。MM纳入标准：①所有MM患者骨髓组织经病理诊断确诊，MM的诊断符合国际骨髓瘤工作组（IMWG）2014年对MM诊断标准[7]；②临床病理资料完整，患者及其家属均知情同意并签字；③患者均为首次诊治，之前未接受过其他治疗。排除标准：①合并其他器官系统的恶性肿瘤；②妊娠期或哺乳期妇女；③合并急性感染性疾病；④合并其他血液系统疾病。病例组男35例，女32例；年龄39～71岁，平均（57.4±7.2）岁；按照国际分期系统（ISS）进行分期，其中Ⅰ期29例，Ⅱ期25例，Ⅲ期13例。病例对照组男22例，女18例；年龄40～70岁，平均（59.2±6.3）岁；其中非霍奇金淋巴瘤13例，急性淋巴细胞白血病9例，慢性粒细胞白血病11例，慢性淋巴细胞白血病7例，该组患者诊断符合2007年《血液病诊断和疗效标准》[8]。健康对照组男21例，女19例；年龄38～68岁，平均（57.0±6.8）岁。三组研究对象性别、年龄比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。本研究经我院医学伦理委员会批准同意。
　　1.2 检测方法
　　实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测各组miRNA-181a和miRNA-373的表达。采用Trizol法提取骨髓组织中总RNA，实验步骤按照Trizol试剂盒说明书进行（购自美国Invitrogen公司，生产批号：127906）。以5 μL总RNA为模板进行反转录合成cDNA，应用TaqMan miRNA逆转录试剂盒（购自美国ABI公司，生产批号：1203125）进行反转录。反应条件：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min。得到cDNA后进行qRT-PCR反应。实验步骤严格按照miRNA-181a和miRNA-373PCR试剂盒说明书进行（购自美国ABI公司，生产批号：20142322、20132618）。反应条件为：95℃ 1 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，72℃ 10 s延伸，40个循环。miRNA-181a反转录引物序列：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACT-GGATACGACAACTCAC-3′，正向引物序列：5′-GCG-GCGAACATTCAACGATG-3′，反向引物序列：5′-GTG-CAGGGTCCGAGG-3′。miRNA-373反转录引物序列：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCA-CTGGATACGACACACCC-3′，正向引物序：5′-GGG-GAAGTGCTTCGATTTTG-3′，反向引物序列：5′-CAG-TGCAGGGTCCGAGGTAT-3′。内参基因U6反转录引物序列：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAAT-TCAGTTGAGATATGGAA-3′，上游序列：5′-ACACT-CCAGCTGGGATTCGTGAAGCG-3′，下游序列：3′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGG-5′。反转录引物、PCR引物和探针均购自ABI生物公司。所有反应均在ABI实时定量PCR仪上完成，每个样本重复3次。采用相对Ct值进行数据分析，目的基因miR-181a/miRNA-373 mRNA的表达水平相对于内参基因U6的比值为2-ΔΔCt，计算miR-181a/miRNA-373的相对定量表达水平，其中ΔCt = CtmiR-181a/miRNA-373-CtU6。
　　1.3 统计学方法
　　采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），SNK-q法检验；相关性分析采用Pearson线性相关分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 各组骨髓组织中miRNA-181a、miRNA-373表达比较
　　病例组、病例对照组及健康对照组骨髓组织中miRNA-181a的相对表达水平分别为（123.17±19.10）、（73.32±12.65）、（64.11±10.05）。病例组miRNA-181a表达显著高于病例对照组及健康对照组（t = 3.458、3.679，P = 0.000、0.000），而病例对照组与健康对照组比较，差异无统计学意义（t = 0.247，P = 0.805）。病例组、病例对照组及健康对照组骨髓组织中miRNA-373的相对表达水平分别为（0.41±0.10）、（0.82±0.07）、（1.01±0.12），病例组miRNA-373表达显著低于病例对照组及健康对照组（t = 2.114、2.613，P = 0.038、0.011），而病例对照组与健康对照组比较，差异无统计学意义（t = 0.529，P = 0.598）。见图1。 　　2.2 病例组miRNA-181a、miRNA-373表达与MM临床病理特征的相关性
　　病例组患者骨髓组织中miRNA-181a、miRNA-373表达与肿瘤分期、肿瘤分化有关（均P < 0.05），而其与年龄、性别、细胞学分型及淋巴结转移无关（均P > 0.05）。见表1。
　　2.3 各组miRNA-181a、miRNA-373表达的相关性
　　病例组骨髓组织中miRNA-181a与miRNA-373表达呈显著负相关（r = -0.696，P = 0.000）。见图2。病例对照组和健康对照组miRNA-181a与miRNA-373表达无明显相关性（r = 0.051、0.179，P = 0.206、0.097）。
　　3 讨论
　　随着对MM发病机制研究的不断深入，寻找早期诊断、治疗和判断预后的肿瘤标志物是学者们研究的重点。非编码RNA包括miRNA、lncRNA等，可以在RNA 水平行使各自的生物学功能。多种miRNA通过调节相关基因的表达参与MM的发生、发展病理生理过程。有学者[10]在体外细胞实验中发现，骨髓瘤细胞miR-181a表达上调促进肿瘤细胞的增殖和迁移。本研究病例组miRNA-181a表达显著高于病例对照组及健康对照组，而病例对照组及健康对照组的表达差异无统计学意义（P > 0.05），与以往研究[11]结果一致。其机制可能与肿瘤微环境中白细胞介素-1β（IL-1β）生成增加导致miRNA-181a表达上调有关，miRNA-181a结合下游抑癌基因PTEN mRNA的3′UTR区，抑制翻译过程，促进肿瘤细胞增殖，当shRNA下调miRNA-181a表达后，其促进增殖的作用得到逆转[12-13]。病例组患者骨髓组织中miRNA-181a表达与肿瘤分期、肿瘤分化有关，肿瘤分期越高，肿瘤分化越差，骨髓组织中miRNA-181a表达越高，与以往报道[14]一致。其机制可能是miRNA-181a高表达能显著上调细胞周期的关键启动因子Cyclin D，促进G1期向S期的转换，导致肿瘤细胞异常增殖[15]。此外，miRNA-181a高表达激活PI3K-Akt信号转导通路，促进下游基因表达，如微管蛋白的合成，进而促进肿瘤细胞迁移[16]。
　　研究[17]表明，位于染色体19q13.42的miRNA-373在肿瘤发生和转移中起关键作用。本研究病例组患者的miRNA-373表达水平显著低于病例对照组及健康对照组，而病例对照组与健康对照组miRNA-373表述无显著差异，其机制可能是miRNA-373基因位点的杂合性缺失或基因表观遗传学修饰，如甲基化、泛素化等等引起的基因功能失活[18]。此外，RNA Pol Ⅲ负责miRNA的产生并有助于调节细胞的生物合成能力，某些作为聚合酶成分的因子如BRF2异常时，引起RNA Pol Ⅲ转录的失调，也可导致关键RNA的生成异常，导致细胞生长失控[19]。此外，肿瘤分期越高，肿瘤分化越差，骨髓组织中miRNA-373表达越低。其原因可能是miRNA-373在肿瘤的发生和发展中起抑制基因的作用，miRNA-373能抑制RAS通路中的几个关键基因的表达，如RAB22A、RASSF1A等，进而抑制肿瘤细胞的增殖，当shRNA沉默miRNA-373表达后，其抑制增殖的作用消失[20]。miRNA-373能直接靶向LATS2，抑制肿瘤細胞的迁移和侵袭能力[21-22]。此外，上皮间质转化（EMT）对肿瘤的迁移和侵袭至关重要，miRNA-373表达显著下调时，影响下游靶基因IRAK2与LAMP1的表达，导致EMT的上皮标志物E-钙黏蛋白的表达降低，间充质标志物N-钙黏蛋白的表达增加[23]。此外，本研究中miRNA-181a与miRNA-373间表达呈显著负相关，而两者在病例对照组和健康对照组中的表达无明显相关性。因此，miRNA-181a与miRNA-373可能通过肿瘤癌基因、抑癌基因及肿瘤细胞增殖的调控过程参与多发性骨髓瘤的发生、发展过程。
　　综上所述，多发性骨髓瘤患者骨髓组织中miRNA-181a表达增加，而miRNA-373表达减少，两者共同参与肿瘤的发生、发展过程，可能成为多发性骨髓瘤诊断、治疗及预后评估的新的肿瘤标志物。但本研究样本量少，两者的具体作用机制尚待进一步研究。
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　　（收稿日期：2019-01-15 本文编辑：王 蕾）
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