PLGA携三七皂苷Rb1微球的制备及实验条件优化研究

来源:用户上传      作者:杨丹 姜岚 朱梅 陈洪艳

　　 【摘要】 目的：使用聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）携带包载三七皂苷Rb1制备纳米微球并优化实验条件，寻求包封率及平均粒径的最优制备条件。方法：制备纳米微球使用复乳-溶剂挥发法，使用高效液相色谱仪测定包封率，激光粒度分析仪测定平均粒径。使用SPSS 13.0统计学软件，对影响包封率及平均粒径的因素分别进行五因素四水平正交实验，分析包封率及粒径制备的最优条件。结果：PLGA浓度10 mg/mL，O︰W1为10︰3，W2︰W1/O为2︰1，第1次超声乳化时间10 s，第2次超声乳化时间90 s的条件下制备的微球包封率最佳。对于粒径来说，每个因素最佳的水平分别为PLGA浓度20 mg/mL，O︰W1为1︰5，W2︰W1/O为2︰1，第1次超声乳化时间10 s，第2次超声乳化时间120 s。结论：高分子有机化合物PLGA可作为为外壳材料包被携带三七皂苷Rb1，通过实验优化可获得其包封率及粒径制备的最优条件。
　　 【关键词】 聚乳酸-羟基乙酸共聚物 三七皂苷Rb1 复乳-溶剂挥发法 包封率 粒径
　　 Preparation of PLGA Loaded Panax Notoginseng Saponin Rb1 Nanoparticles and Optimization of Experimental Conditions/YANG Dan， JIANG Lan， ZHU Mei， CHEN Hongyan. //Medical Innovation of China， 2020， 17（03）： -154
　　 [Abstract] Objective： To prepare nanospheres of panax notoginseng saponin Rb1 with PLGA and optimize the experimental conditions， and to find the optimal preparation conditions of encapsulation rateand average particle size. Method： PLGA loaded panax notoginseng saponin Rb1 nanoparticles were prepared by double emulsion solvent evaporation method. The encapsulation rate was determined by high performance liquid chromatograph and the average particle size was determined by laser particle size analyzer. Five factors and four levels of orthogonal experiments were carried out on the factors affecting the encapsulation rate and the average particle size by SPSS 13.0 statistical software. The optimal conditions of encapsulation rate and particle size preparation were analyzed. Result： When PLGA concentration was 10 mg/mL， O︰W1 was 10︰3， W2︰W1/O was 2︰1， the first time of phacoemulsification was 10 s， and the second time of phacoemulsification was 90 s， the encapsulation efficiency of microspheres was the best. PLGA concentration was 20 mg/mL， O︰W1 was 1︰5， W2︰W1/O was 2︰1， the first time of phacoemulsification was 10 s， the second time of phacoemulsification was 120 s for the best preparation factor of particle size. Conclusion： The polymeric organic compound PLGA can be used as the shell material to carry panax notoginseng saponin Rb1. The optimal conditions of encapsulation rate and particle size preparation can be obtained by experimental optimization.
　　 [Key words] PLGA Panax notoginseng saponin Rb1 Double emulsion solvent evaporation method Encapsulation rate Particle size
　　 First-author’s address： Faculty of Chemistry Biology and Environment， Yuxi Normal University， Yuxi 653100， China
　　 doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.03.038
　　 三七皂苷Rb1為三七的单体皂苷成分，具有活血化瘀、消肿、定痛的作用，可抑制炎性细胞趋化与增殖，降低炎性介质的释放[1-2]。研究显示Rb1口服后的肠壁吸收机制为单纯被动扩散，在吸收过程中，受胃酸性环境、大肠菌丛酶的降解及肝首关消除的影响，其生物利用度降低，并且肠道黏膜的透过性低是常规口服制剂生物利用度低的主要因素[3-4]。因此稳定并且高生物利用度的Rb1口服制剂亟待研究[5-6]。聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）是一种具备可降解功能的高分子有机化合物，在人体内最终降解产物为二氧化碳和水，具良好的生物相容性、无毒、良好的成囊和成膜的性能[7-8]，被广泛应用于制药、医用工程材料和现代化工业领域[9-11]，国内外有很多学者们研究使用PLGA作为壳载体来包埋亲水性药物制作纳米微球[10-16]。本研究使用PLGA作为载体材料携带三七皂苷Rb1，以包封率及平均粒径为指标，寻求最优制备条件。现报道如下。 　　1 材料与方法
　　1.1 仪器与试剂 PLGA（分子量，LA︰GA=50︰50，
　　Aladdin industrial Corporation）/三七皂苷Rb1（上海源叶生物科技有限公司）、聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA，Sigma-Aldrich Corporation）、二氯甲烷。超声细胞破碎仪（SCIENTZ-IID，宁波新芝生物科技股份有限公司）、高效液相色谱仪（Agilent 1260 Infinity）、Hypersil GOLD液相色谱柱（250×4.6 mm×5 μm，Thermoscientific）、激光粒度分析仪（英国马尔文）、磁力搅拌器（温州标诺仪器有限公司，78-1）、低温冷冻离心机（Allegra? X-15R）、超纯水仪（UPT-I-5/10/20T，西安优普仪器设备有限公司）、电子天平（Precisa ES225SM-DR）。
　　1.2 微泡的制备方法 使用复乳溶剂法制备以PLGA为载体的携三七皂苷Rb1纳米粒微泡。精密称取PLGA并溶于二氯甲烷中，制成PLGA-二氯甲烷溶液（油相O）;称取一定质量的三七皂苷Rb1并制成相应浓度的水溶液作为内水相（W1）;配置1% PVA水溶液为外水相（W2）。混合W1相与O相，将混合乳放入超声波细胞破碎以行第1次超声乳化（300 W，T1），制得初乳（W1/O），将初乳快速加入外水相中，再次置入超声波细胞破碎仪进行第2次超声乳化（300 W，T2），即可得到复乳。将得到的复乳至于室温下搅拌4 h，待有机溶剂充分挥发，得到三七皂苷Rb1-PLGA混悬液。将上述液体分装入离心管内离心（5 min，4 000 r/min），收集上清，蒸馏水洗涤3次并离心后收集全部上清。洗涤后的混悬液沉淀干燥后既得干粉，将其置于4 ℃冰箱中保存、备用。使用马尔文激光粒度仪测量平均粒径。前期的预实验单因素分析中筛选出在制备过程中对微球包封率及粒径有影响的五种因素，分别是X1（PLGA浓度，mg/mL）、X2（O相体积与W1相体积比）、X3（外水相W2与初乳W1/O体积比）、X4（第1次超声乳化时间，T1）、X5（第2次超声乳化时间，T2）;每个因素选4个水平，按L16（45）正交表安排实验，水平重复实验3次。见表1。
　　1.3 高效液相色谱仪三七皂苷Rb1含量测定 A相为乙腈，B相为水，按表2进行梯度洗脱;检测波长203 nm;进样量20 μL;流速1.0 mL/min。
　　1.4 三七皂苷Rb1标准曲线的制备 分别称取一定质量三七皂苷Rb1，配制不同浓度三七皂苷Rb1溶液，按照前述1.3下色谱条件得到的结果，以峰面积（A）对质量浓度（ρ）进行线性回归，得到Rb1标准曲线：A=2.543 6ρ-29.556（r=0.997 6）。
　　1.5 包封率的测定 取1.2中洗涤离心所收集的所有上清，据1.3下色谱条件进行高效液相测定，并根据1.4得到的标准曲线，可得到游离药物量（cfree），按以下公式计算包封率（entrapment efficiency，EE%）=（ctotal-cfree/ctotal）×100%。
　　1.6 统计学处理 使用SPSS 13.0软件对所得数据进行统计分析，采用正交实验设计、方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　 以三七皂苷Rb1-PLGA微球的包封率及平均粒径为指标，结果见表3～6。影响包封率和平均粒径的因素，五个因素都有统计学意义（P<0.001）。对包封率的影响依次为X2>X3>X5>X4>X1。如果要达到最优包封率，五个因素的最佳选择水平为：PLGA浓度为10 mg/mL，O︰W1为10︰3，W2︰W1/O为
　　2︰1，T1为10 s，T2为90 s;而平均粒径的影响次序依次为X1>X5>X2>X4>X3。对于粒径来说，每个因素最佳的水平分别为PLGA浓度20 mg/mL，O︰W1为1︰5，W2︰W1/O为2︰1，T1为10 s，T2为120 s。
　　 *决定系数=0.995（校正决定系数=0.993）。據Ⅲ型平方和（Type Ⅲ Sum of Squares）大小，可得出对于包封率的影响，五个因素次序依次为X2>X3>X5>X4>X1。
　　 *决定系数=0.983（校正决定系数=0.976）;据Ⅲ型平方和的大小，可得出对于包封率的影响，五个因素次序依次为X1>X5>X2>X4>X3。
　　3 讨论
　　 因为PLGA是一种可降解的功能高分子有机化合物，具良好的生物相容性、无毒、良好的成囊和成膜的性能，被广泛应用于制药、医用工程材料和现代化工业领域[9-11]，国内外有很多学者们研究使用PLGA作为壳载体来包埋亲水性药物制作纳米微球[10-16]。因此本实验构建的纳米粒由PLGA为成膜材料，由于三七皂苷Rb1是水溶性，因此选取了适合水溶性药物的复乳-溶剂挥发法[17-18]。笔者在外水相中加入了乳化剂（1% PVA），其作用是使有机相在水相中分散成细小液滴，从而保证了足够的表面活性剂分子覆盖有机相与外部水相界面，提高液滴的聚结保护作用[14]。以包封率和平均粒径作为指标进行优化制备工艺。正交实验结果显示，PLGA浓度、O︰W1、W2︰W1/O、T1、T2对包封率及平均粒径均有影响。对于包封率来说，最佳PLGA浓度为10 mg/mL（X1水平2），可能因为当PLGA浓度过低时（5 mg/mL，X1水平1），体系中的PLGA不足以完全包封Rb1，而当PLGA浓度过高时（20、40 mg/mL，X1水平3、4），W1相内的Rb1浓度不变，但此时PLGA相对过剩，反而不能有效提高包封率;油相与内水相体积比增大，在一定范围内包封率上升，但当上升至一定程度时反而包封率下降，最佳的O︰W1为10︰3，这与文献[19]报道相符。而随着W2︰W1/O的增加，包封率下降，并且T1为10 s，T2为90 s时包封率达到最高。对于纳米粒微球粒径来说，随PLGA浓度的增加，平均粒径逐渐减小，这与文献[20]报道的相符，而随着W2︰W1/O增大，平均粒径也增大。 　　 综上所述，使用复乳-溶剂挥发法，PLGA为载体可成功制备三七皂苷Rb1微球，优化实验条件为：当PLGA浓度10 mg/mL，O︰W1为10︰3，
　　W2︰W1/O為2︰1，T1为10 s，T2为90 s的条件下制备的微球包封率最佳。如果要获得最小粒径，各因素分别为PLGA浓度20 mg/mL，O︰W1为1︰5，W2︰W1/O为2︰1，T1为10 s，T2为120 s。
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　　（收稿日期：2019-07-09） （本文编辑：董悦）
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