响应面法优化雪胆多酚提取工艺

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　　摘要：以雪胆（Hemsleya chinensis）为试验材料，采用Box-Behnken中心组合设计响应面优化的方法，优化雪胆多酚的提取工艺条件。以多酚提取率作指标，通过Design-Expert 8.0.6软件，基于单因素试验结果，建立雪胆多酚提取率与提取温度、乙醇浓度、液料比、提取时间4因素3水平的数学模型。结果表明，雪胆多酚提取率模型拟合度较好，显著性高，优化后的最佳提取工艺条件为提取时间59 min、乙醇浓度（V/V）50%、提取温度74 ℃、液料比16∶1（mL/g），此条件下雪胆多酚提取率为（1.479 6±0.004 1） mg/g。
　　关键词：雪胆（Hemsleya chinensis）;多酚;提取;响应面法
　　中图分类号：R284         文献标识码：A
　　文章编号：0439-8114（2020）17-0112-07
　　Abstract： Taking Hemsleya chinensis as the experimental material， the Box-Behnken central composite design and response surface methodology were used to optimize the extraction conditions of polyphenols from Hemsleya chinensis. The extraction rate of polyphenols was used as index. Based on the results single factor experiments， a mathematical model of 4 factors and 3 levels center combinations was established with the Design-Expert 8.0.6 software on the extraction temperature， ethanol concentration， liquid to material ratio， extraction time. The results showed that the fitting degree of polyphenol extraction rate model was good and significant. The best process parameters were extraction time 59 min， ethanol concentration （V/V） 50 %， extraction temperature 74 ℃， and liquid to material ratio 16∶1（mL/g）. Under these conditions， the extraction rate of polyphenols from H. chinensis was （1.479 6±0.004 1） mg/g.
　　Key words： Hemsleya chinensis; polyphenols; extraction; response surface methodology
　　雪胆（Hemsleya chinensis）是葫蘆科雪胆属植物，是常见的中草药，主要分布于云南省、四川省、贵州省等地[1，2]。雪胆的主要有效成分有雪胆甲素、雪胆乙素和齐墩果酸等，能清热解毒和消炎杀菌，并用于治疗上呼吸道感染、支气管炎、细菌性痢疾、肠炎等疾病[3，4]。多酚类化合物是一类具有多个酚基团的次生代谢产物，广泛分布于植物的皮、根、叶和果肉之中，具有清除自由基等生理功能，除了具有良好的抗氧化功能外，还具有降低血脂肪、增强人体免疫力、防止动脉硬化和血栓形成、促进肠胃消化等作用[5-8]，所以含有多酚的植物作为天然抗氧化剂，在生物医药领域受到广泛的关注。
　　近年来，国内外学者对雪胆化学成分、药理活性和作用机制等方面进行了大量研究，并取得较大进展[9，10]，但对雪胆多酚提取工艺的研究未见报道。为进一步研究雪胆并有效利用雪胆资源，本研究以雪胆为试验材料优化多酚提取工艺，回流提取法是多酚的主要提取方法[11-17]，为有效且充分提取多酚，选用乙醇作为提取溶剂，采用回流提取法提取雪胆多酚，探讨利用响应面优化雪胆多酚的提取工艺，为其开发利用提供基础依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料与试剂
　　供试材料雪胆为葫芦科雪胆属雪胆，采自云南柯兆生物科技有限公司种植基地。经粉碎过100目筛，密封于干燥器中备用。
　　福林-酚试剂购自国药化工集团有限公司，没食子酸标准品购自上海源叶生物科技有限公司，无水碳酸钠购自西陇化工有限公司，无水乙醇购自天津风船化学试剂科技有限公司。
　　1.2 仪器与设备
　　722N可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司;ISO9001电子天平，北京赛多利斯天平有限公司;DRHH-1数显恒温水浴锅，上海双捷实验设备有限公司;DC-600高速多功能粉碎机，浙江武义鼎藏日用金属制品厂。
　　1.3 试验方法
　　1.3.1 雪胆多酚的提取 将雪胆块茎放入粉碎机磨碎，过100目筛得到样品置于干燥器备用。称取4.00 g样品进行回流提取，提取结束后趁热过滤，待滤液冷却至室温后用提取溶剂定容至100 mL，得雪胆多酚提取液。
　　1.3.2 没食子酸标准曲线的制作 根据Folin-Ciocalte法并稍作修改[18]。称取0.01 g没食子酸标品溶解于10 mL乙醇中并用去离子水定容至100 mL，得到0.1 mg/mL的没食子酸标准溶液。分别量取0、2、4、6、8、10 mL没食子酸标准溶液于100 mL容量瓶中，再加入1 mL 福林-酚试剂，在室温下反应5 min后加入2 mL 10%的碳酸钠溶液，用去离子水定容，避光反应2 h，在765 nm处测定吸光度值，重复2次取平均值，以没食子酸浓度和吸光度值分别为横、纵坐标，绘制没食子酸标准曲线。根据没食子酸标准曲线计算雪胆提取液中多酚的含量和多酚浓度。 　　1.3.3 雪胆多酚提取率的计算 将没食子酸标准溶液用10 mL雪胆多酚提取液替代，按“1.3.2”方法测定吸光度值，雪胆多酚提取液中多酚浓度由没食子酸标准曲线的回归方程计算得出，雪胆多酚提取率的计算公式如下：
　　[多酚提取率（mg/g）=C×Va×VbM×V]     （1）
　　式中，C表示多酚浓度（mg/mL），Va表示容量瓶量程（mL），Vb表示提取液总体积（mL），M表示样品质量（g），V表示取液量（mL）。
　　1.3.4 单因素试验
　　1）提取时间。为探讨提取时间对雪胆多酚提取率的影响，以60%乙醇为提取剂，液料比10∶1（mL/g，下同），70 ℃恒温水浴的提取条件下分别回流提取30、45、60、75、90 min。
　　2）提取温度。为探讨提取温度对雪胆多酚提取率的影响，以60%乙醇为提取剂，液料比10∶1，提取时间60 min，恒温水浴温度分别为50、60、70、80、90 ℃的提取条件下回流提取。
　　3）液料比。为探讨液料比对雪胆多酚提取率的影响，以60%乙醇为提取剂，提取时间60 min，70 ℃恒温水浴，液料比分别为5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1的提取条件下回流提取。
　　4）乙醇浓度。为探讨乙醇浓度对雪胆多酚提取率的影响，设置提取时间60 min，液料比10∶1，乙醇浓度分别为20%、40%、60%、80%、100%，70 ℃恒温水浴条件下回流提取。
　　1.3.5 响应面试验 基于单因素试验结果，结合响应面Box-Behnken的设计方法，以多酚提取率作响应值，建立雪胆多酚提取率与提取温度、液料比、提取时间、乙醇浓度之间的4因素3水平的数学模型（表1）。
　　1.4 数据处理
　　采用SPSS Statistics 20软件进行LSD多重比较和方差分析（P<0.05），并用SigmaPlot 12.5和Design-Expert 8.0.6软件作图。
　　2 结果与分析
　　2.1 没食子酸标准曲线的建立
　　以没食子酸浓度和吸光度值分别为横、纵坐标绘制标准曲线，得到没食子酸标准曲线的回归方程为Y=69.086X+0.008 2，R2=0.999 6。由图1可见，没食子酸浓度在0～0.010 mg/mL与吸光度值线性关系良好。
　　2.2 单因素试验结果
　　2.2.1 提取时间对雪胆多酚提取率的影响 由图2可知，当提取时间为60 min时，雪胆多酚提取率最高。当提取时间小于60 min时，过短的提取时间可能会使雪胆多酚提取不完全，但延长提取时间也可能会导致提取液中多酚被氧化，使雪胆多酚提取率降低，故将响应面试验的提取时间设定为45～75 min。
　　2.2.2 提取温度对雪胆多酚提取率的影响 由图3可知，当提取温度为80 ℃时，雪胆多酚提取率最高。当提取温度小于80 ℃时，温度的升高可能会加快溶剂对雪胆样品的渗透速度，氢键更容易被破坏，因此雪胆多酚提取率呈上升趋势。当温度大于80 ℃时，高温可能会引起样品内多酚发生氧化或降解反应，使雪胆多酚提取率降低，故将响应面试验提取温度设定为60～80 ℃。
　　2.2.3 液料比對雪胆多酚提取率的影响 由图4可知，当液料比小于15∶1时，雪胆多酚提取率随着液料比的增加而增大，可能原因是当液料比增加后，样品在溶液中的分散程度增大，增加了接触面积从而提高提取率。当液料比为15∶1时，雪胆多酚提取率达到最大。当液料比达到15∶1后，溶剂趋于饱和，随着液料比的增加雪胆多酚提取率反而减少，可能原因是当液料比过大时，可溶性蛋白、多糖和果胶等物质被提取出，多酚可能被这些物质吸附或与之反应，使多酚提取率减小，故将响应面试验液料比设定为10∶1～20∶1。
　　2.2.4 乙醇浓度对雪胆多酚提取率的影响 由图5可见，当乙醇浓度小于40%时，随着乙醇浓度的增加，雪胆多酚提取率逐渐增大，可能原因是低体积分数乙醇无法有效断裂多酚与其结合物之间的氢键，不利于多酚的提取。当乙醇浓度大于40%时，雪胆多酚提取率随着乙醇浓度的增加反而减小。当乙醇浓度为40%时，雪胆多酚提取率达到最大，根据相似相溶原理，可能是由于雪胆多酚的极性与40%乙醇的极性相同，故将响应面试验乙醇浓度设定为40%～80%。
　　2.3 响应面试验结果与分析
　　2.3.1 二次响应面回归模型的建立 根据Design Expert 8.0.6统计软件的分析，得到响应面的试验设计，以雪胆多酚提取率作响应值，设计提取温度、液料比、提取时间和乙醇浓度4因素3水平的数学模型，结果见表2。
　　2.3.2 回归方程及方差分析 对响应面试验结果使用Design Expert 8.0.6软件进行分析可得表3，各因素与响应值的二次多项式方程为Y=14.25+0.30A+0.39B - 0.15C + 0.48D + 0.25AB - 0.047AC + 0.012AD-0.099BC- 0.17BD + 0.17CD - 0.47A2 - 0.75B2 - 0.92C2 -0.45D2。P水平是检验回归系数的标准，当P<0.01 时，回归方程极显著;当P<0.05 时，回归方程显著;当P>0.05 时，回归方程不显著。
　　由表3可知，该模型的P值小于0.000 1，模型极显著，失拟误差P值等于0.000 1，失拟误差极显著，表明模型与实际情况拟合较好，模型R2=0.957 4表明预测值和实测值之间存在高度相关性，并且能准确反映试验因素对响应值的影响，所以可以使用此回归方程并预测试验结果。回归模型的显著性检验表明，A、B、D对多酚提取率有极显著影响（P<0.01），C、AB对多酚提取率有显著影响（P<0.05），AC、AD、BC、BD、CD对多酚提取率影响不显著，二次项影响均为极显著（P<0.01）。提取因素对雪胆多酚提取率的影响大小为：乙醇浓度>液料比>提取温度>提取时间。 　　2.3.3 两因子间交互作用分析 由图6可知4个因素中任意2个变量在其余变量取零水平时对雪胆多酚提取率的影响，各图交互作用的趋势都是先增后减，从各图的变化幅度及等高线的疏密可以看出，图a、b、c、e、f的交互作用不显著。图d响应面的坡度很陡，可以得出提取温度和液料比的交互影响对多酚提取有显著影响，从图d可看出液料比轴的等高线变化稀疏，提取温度轴的等高线变化密集，液料比变化曲面的变化幅度大于提取温度，表明液料比变化对多酚提取率的影响大于提取温度。
　　2.3.4 最佳工艺条件预测及验证 通过Design-Expert 8.06软件分析可得雪胆多酚的最佳提取工艺条件为提取温度74.04 ℃、乙醇浓度49.6 %、液料比16.4∶1、提取时间59.06 min，此时能够得到的多酚理论提取率为1.485 3 mg/g。为方便具体操作，将条件修改为提取温度74℃、乙醇浓度50%、液料比16∶1、提取时间59 min，并测定3次雪胆多酚提取率，所得平均提取率为（1.479 6±0.004 1） mg/g，与雪胆多酚理论提取率1.485 3 mg/g相比误差小，所建立的回归模型可靠，最佳提取工艺可行。
　　3 小结
　　多酚提取方法主要包括微波辅助萃取法、超声波辅助萃取法、酶解提取法和有机溶剂萃取法等。本研究以乙醇作为提取剂，采用回流提取工艺，以多酚提取率作指标，基于单因素（提取温度、乙醇浓度、液料比和提取时间）试验结果，采用4因素3水平的响应面设计优化雪胆多酚的最佳提取工艺，结果表明，雪胆多酚提取率模型拟合度很好，雪胆多酚的最佳提取工艺条件为提取温度74 ℃、乙醇浓度50%、液料比16∶1、提取时间59 min，此条件下雪胆多酚提取率为（1.479 6±0.004 1） mg/g，与雪胆多酚理论提取率1.485 3 mg/g相比误差小，验证该模型是有效的。提取因素对雪胆多酚提取率的影响大小为：乙醇浓度>液料比>提取温度>提取时间。
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