响应面法优化仙茅多糖酶解工艺及体外免疫活性

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　　摘要：采用葡聚糖酶对仙茅多糖XMP-1进行酶解，并利用响应面法对酶解工艺进行合理优化。在单因素试验的基础上，采用星点设计模拟葡聚糖酶酶添加量、酶解温度、时间、pH值等4个因素对还原糖生成量综合影响的模型，得到最佳工艺条件，并验证模型的可靠性。通过小鼠巨噬细胞（RAW264.7）分析XMP-1 1～12 h酶解得到的12批产物的体外免疫活性。结果表明，最佳酶解工艺为酶添加量为56%，温度为52 ℃，酶解时间为12 h，pH值为6.0，此时还原糖生成量为0.201 0 mg/mL。优化结果可靠，与预测值的相对误差小于5%。不同时间段酶解产物对细胞无明显毒害作用，均能诱导RAW264.7细胞活化，释放TNF-α和NO，其中酶解5 h的效果最好。该研究可为仙茅多糖酶降解片段的制备提供理论基础，也可为仙茅多糖在食品领域进一步开发和应用提供科学依据。
　　关键词：仙茅;多糖;葡聚糖酶;酶解工艺;响应曲面法;体外免疫诱导活性
　　中图分类号： R284.1文献标志码： A
　　文章编号：1002-1302（2020）08-0229-09
　　收稿日期：2019-03-14
　　基金项目：国家自然科学基金（编号：81460597）;贵州省科技平台及人才团队计划（编号：黔科合平台人才[2017]5614）。
　　作者简介：杨 玲（1991—），女，贵州毕节人，硕士研究生，研究方向为天然药物成分及生理活性。E-mail：18275269165@163.com。
　　通信作者：杨 娟，博士，研究员，主要从事多糖及寡糖研究。E-mail：yangxz2002@126.com。
　　仙茅作为石蒜科植物仙茅（Curculigo orchioides Gaertn）的根茎，是临床常用的辛热药之一，主要用于治疗肾阳不足、虚痨内伤、腰膝冷痛、筋骨痿软等虚寒症状[1-2]。它的组成成分主要包括酚性化合物及酚苷、三萜皂苷、植物多糖、木脂素苷类、黄酮类化合物、苯环取代物、挥发油等[3-4]。药理研究结果显示，仙茅具有抗氧化、增强免疫力、延缓生殖系统老化、抗骨质疏松、保肝、保护心血管等作用[5]，仙茅多糖具有免疫调节、对抗肿瘤药氟尿嘧啶减毒增效、加强青蛙心脏的收缩、抗骨质疏松等作用[6]。目前对于仙茅多糖成分的研究只有国内外少量文献报道，且主要研究其药理作用，而将仙茅多糖酶解为寡糖的研究尚未见报道。
　　由于多糖是通过其特异性寡聚糖片段与受体相结合而介导免疫反应的，因此对寡聚糖活性片段进行研究对探讨仙茅多糖作用机制具有关键作用[7-8]。降解多糖的方法主要有化学、物理和酶降解法等;酸降解法和氧化降解法是常用的化学降解法，简单易行，但是对于降解产物的聚合度难以控制，降解得率低;目前大多数物理降解方法还只是处于实验室阶段，还需要进行更深入的研究;酶降解法与化学、物理降解法相比，具有反应条件温和、产物均一性好、聚合度适中、得率高、无污染等优点，且能最大程度地保护反应底物的活性基团不受破坏[9-10]。选择合适的降解酶对多糖进行酶法修饰，不仅可以更好地探讨多糖的结构与功能关系，进而探寻多糖的活性中心，而且可为药物筛选提供各种结构类型的候选化合物[11]。另外，植物多糖虽然来源丰富，性质稳定，但其分子量大，黏度大，扩散困难，结构复杂，导致其的吸收受到阻碍，进而使其應用范围受到限制。将植物多糖降解成适宜的、较低分子量的寡糖片段，能够使其结构更为清晰[12]。寡糖由于结构相对简单，有人工合成的可能性，其溶解性、稳定性和安全性相对较好[13]。因此，对多糖进行酶法修饰已成为多糖构效关系研究的重要手段，也是发现和研制糖类药物的重要途径。本研究利用响应面法优化仙茅多糖葡聚糖酶酶解工艺，并用小鼠巨噬细胞RAW264.7分析不同时间段酶解产物的体外免疫诱导活性，以期为仙茅多糖低分子量降解片段的制备提供理论基础，对深入研究仙茅多糖构效关系及更好地开发利用仙茅多糖具有重要意义。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料与仪器
　　仙茅，购自贵州省贵阳市万东桥药材市场，经贵阳中医学院孙庆文教授鉴定为仙茅（Curculigo orchioides Gaertn）的根，干燥粉碎过40目筛。Sephadex G-50层析柱，美国Pharmacia Sweden公司;DEAE纤维素柱，上海恒信化学试剂有限公司;小鼠巨噬细胞系RAW264.7，中国科学院典型培养物保藏委员会昆明细胞库;DMWM培养基、胰酶（HyClone，J140032）、Mouse TNF-α ELISA试剂盒（DKW12-2012-096）、NO检测试剂盒（BLUEGENE，E03N0041），北京达科为生物技术有限公司;3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二甲基四氮D唑溴蓝（MTT，822A055），北京索莱宝科技有限公司;胎牛血清（FBS，20150914），浙江天杭生物科技股份有限公司;其他试剂均为国产分析纯。
　　自动部分收集器（BS-100A），上海精科实业有限公司;紫外可见分光光度计（UV-1800），日本岛津仪器有限公司;旋转蒸发仪（Buchi R114），Switzerland公司;数显恒流泵（HL-2B），上海精科实业有限公司;数显加热磁力搅拌器（C-MAG HS 7），德国IKA集团;酶联免疫检测仪（1510）、水套式CO2培养箱（USA3131），美国热电公司;倒置显微镜（03040108），日本尼康公司。
　　1.2 试验方法
　　1.2.1 仙茅粗多糖的提取及分离纯化
　　用80%乙醇回流提取仙茅干药粉2次，每次2 h，除去低聚糖、单糖及脂溶性成分后，按照仙茅干药粉和蒸馏水的料液比为1 g ∶35 mL，沸水浴提取150 min，然后将提取液浓缩至黏稠状，5倍无水乙醇醇沉，静置过夜，干燥得到仙茅粗多糖。对仙茅粗多糖采用DEAE-纤维素柱进行层析（Φ12.6 cm×100 cm），流速为5 mL/min，40 min/管，用纯净水进行洗脱;再经Sephadex G-50凝胶柱层析进行纯化（Φ 2.6 cm×85 cm），流速为1.2 mL/min，6 min/管，用纯净水进行洗脱。凝胶渗透色谱法：Agilent PL aquagel-OH MIXED色谱柱（7.5 mm×300 mm，8 μm），流动相为0.05 mol/L Na2SO4溶液，流速为 1.0 mL/min，温度为35 ℃，进样量为80 μL，检测器为示差折光检测器;用流动相溶解10 mg多糖样品于10 mL容量瓶中，进行高效液相色谱分析。凝胶渗透色谱法测定结果分析：采用以标准品的相对分子质量对数与对应的洗脱体积绘制标准曲线，再根据样品洗脱体积求得其相对分子质量[14]。对仙茅多糖纯化后样品进行纯度鉴定。 　　1.2.2 仙茅多糖的酶解工艺及评价指标
　　取纯化后的仙茅多糖30 mg加5 mL纯净水→50 ℃下搅拌30 min使其充分溶解→加入16.8 mg葡聚糖酶、15 mL pH值为6的KH2PO4/K2HPO4缓冲液→52 ℃ 下反应12 h→沸水浴15 min终止反应→过滤→浓缩至10 mL→酶解产物的混合物。
　　从酶解产物中分别移取2 mL置于30 mL具塞试管中，加入3，5-二硝基水杨酸（DNS）溶液 3 mL，混合均匀后，沸水浴7 min，急速冷却，补水至25 mL。以还原糖含量为指标，绘制葡萄糖标准曲线：y=0.801 1x+0.006 8（r2=0.999 8，线性范围为0.08～0.48 mg/mL），计算酶解产物的还原糖含量。
　　1.2.3 仙茅多糖酶解工艺的单因素试验
　　考察酶添加量、温度、时间、pH值对仙茅纯多糖酶解得到的还原糖含量的影响。在酶解温度为55 ℃、时间为10 h、pH值为5.5条件下，设酶添加量分别为20%、30%、40%、50%、60%、70%;在酶添加量为50%、时间为10 h、pH值为5.5条件下，分别设酶解温度为10、20、30、40、50、60、70 ℃;在酶添加量为50%、温度为50 ℃、pH值为5.5条件下，分别设酶解时间为3、6、9、12、15、18 h;在酶添加量为50%、温度为50 ℃、时间为 12 h 条件下，分别设pH值为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，对仙茅多糖酶解工艺进行单因素试验。
　　1.2.4 响应面法优化试验
　　在单因素考察基础上，以酶添加量（A）、温度（B）、酶解时间（C）、pH值（D）为自变量，還原糖生成量为响应值。采用Design Expert 8.05软件进行4因素5水平星点设计试验[15-16]，具体见表1。
　　在含有10%胎牛血清（FBS）、1 mL 10.25%胰酶的90% DMEM培养基接种小鼠巨噬细胞系RAW 264.7细胞，在温度为37 ℃、CO2浓度为5.0%的细胞培养箱中进行传代培养[17]。在酶添加量为56%、温度为52 ℃、pH值为6.0条件下，试验组为100 mg仙茅纯多糖酶解1～12 h，分别得到1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 h等12批酶解产物浓缩干燥，配制成浓度为31.250、125.000、500.000 μg/mL 溶液;空白组（BC）：以DMEM培养基作为空白对照;多糖组（XMP-1）：将未酶解的浓度为 125.00 μg/mL 的仙茅多糖溶液命名为XMP-1，作为多糖组。以每孔106个细胞的浓度将RAW264.7细胞接种于96孔（100 μL/孔）细胞培养板中，加入试验组、空白组和多糖组溶液各100 μL，置于温度为 37 ℃、CO2浓度为5%的细胞培养箱中孵育 48 h。细胞孵育完成后，每孔加入20 μL MTT，继续培育 4 h 后终止培养，吸取上清，每孔加150 μL二甲基亚砜DMSO，低速（100 r/min）摇床10 min，静置 20 min，待结晶溶解后用酶标仪于490 nm处检测吸光度。根据以下公式计算细胞存活率。
　　存活率=（D药物-D本底）/（D正常-D本底）×100%。
　　1.2.6 RAW264.7细胞免疫因子TNF-α测定
　　细胞接种同“1.2.5”节。于温度为37 ℃、CO2浓度为5.0%的细胞培养箱中培养24、36、48 h，细胞孵育完成后，收集细胞培养上清;然后根据小鼠TNF-α ELISA kit说明手册中进行操作，最后根据标准曲线（y=224.13x-98.989，r2=0.988 6）计算细胞因子TNF-α的浓度[18-19]。
　　1.2.7 酶解组分诱导RAW264.7细胞活化释放免疫因子一氧化氮（NO）
　　采用Griess法测定RAW264.7细胞释放的NO量[20]，细胞接种同 “1.2.5” 节。于温度为37 ℃、CO2浓度为5.0%的细胞培养箱中分别培养24、36、48 h后，加入100 μL Griess试剂[含3 mmol/L磺胺酸，30 mg/L N-1-（萘基）乙二胺二盐酸盐，质量分数25%冰乙酸]，室温避光孵育20 min，离心取细胞上清液，用酶标仪于 450 nm 处测定吸光度，最后根据标准曲线（y=73.86x-3.506，r2=0.988 2）计算NO含量。
　　1.2.8 数据处理及统计
　　活性试验获得的数据采用GraphPad Prism 7.00进行分析，并与空白对照组进行比较。
　　2 结果与分析
　　2.1 仙茅粗多糖的分离纯化
　　运用DEAE纤维素柱对20 g仙茅粗多糖进行初步纯化，用纯净水洗脱自动收集器分部收集，苯 酚- 硫酸法检测，以洗脱管数为横坐标，吸光值为纵坐标，得到一个单一峰（图1），收集单一峰对应部分溶液并浓缩，经Sephadex G-50凝胶柱进一步纯化，用纯净水洗脱，收集吸光度最大的单一峰对应的物质，浓缩干燥，命名为XMP-1（图2）;经凝胶渗透色谱分析发现，色谱峰为单一对称峰（图3），可判断所得纯化产物为分子量分布均一的多糖。
　　2.2 单因素试验结果
　　2.2.1 酶添加量对还原糖生成量的影响
　　由图4可知，在一定范围内还原糖的生成量与酶添加量呈正相关关系，在酶添加量为50%时达到最大值。因此选择50%为酶添加量最佳值。
　　2.2.2 酶解温度对还原糖生成量的影响
　　酶活性的发挥存在最适合的温度，低于或超过该值，酶活性的发挥都会受到影响。从图5可以看出，当温度在50 ℃以下时，温度的增加有利于还原糖的生成。因此选择50 ℃为酶解温度最佳值。 　　2.2.3 酶解时间对还原糖生成量的影响
　　从图6可以看出，在酶解时间为12 h内，还原糖的产生量随酶解时间的增加迅速增加，说明葡聚糖酶对 XMP-1的作用有一个逐渐修饰的过程;在酶解时间为12 h之后，还原糖稍有生产量减少。因此酶解时间为12 h最为合适。
　　2.2.4 pH值对还原糖生成量的影响
　　从图7可以看出，在pH值为6.0时，还原糖生成量达到极大值，说明葡聚糖酶活性的发挥有最佳的pH值，越接近该pH值，越有利于酶活性的发挥。因此选择6.0为pH值最佳值。
　　2.3 响应面法优化试验结果
　　2.3.1 星点设计试验和结果
　　基于单因素考察结果，运用响应面-星点设计法优化仙茅多糖酶解工艺，结果见表2、表3，其中表2为星点设计试验和结果，表3为多糖酶解优化工艺所建立回归方程的方差分析。
　　2.3.2 回归方程的建立及显著性检验
　　通过Design-Expert 8.0.5b软件对表3中的试验结果进行多元线性回归二项式拟合，得到的方程为Y=-0.91605+1.55458A+7.18988×10-3B+0.065132C+0.037327D-1.75421×10-3AB-3.60074×10-3AC+6.83217×10-3AD-1.38490×10-5BC+3.87772×10-5BD-3.97004×10-4CD-1.40070A2-6.00698×10-5B2-2.401 74×10-3C2-3.006 98×10-3D2，R2=0.999 1，其中Y为还原糖生长量，可以看出，方程可信度较好，可以较准确地评估多糖的酶解工艺。从表3可以看出，模型的P值小于0.000 1，说明试验因素对试验结果影响极显著，该模型具有较好的分析预测意义。失拟项的P值等于 0.343 3，大于0.05，说明它对试验结果影响不显著，说明方程拟合程度较好，可用于预测试验结果。各因素方差分析结果显示，对于一次项和二次方项：酶添加量、温度、酶解时间、pH值及其各自二次方项皆对还原糖生成量的影响极显著（P<0.001）;对于交叉项：酶添加量和温度的交互作用对还原糖生成量的影响极显著（P<0.001）;酶添加量和酶解时间的交互作用、酶添加量和pH值的交互作用、酶解时间和pH值的交互作用对还原糖生成量的影响高度显著（P<0.01）;温度和pH值的交互作用对还原糖生成量的影响不显著（P>0.05）;表明各因素与还原糖生成量之间不是简单线性关系。由F值可得，4因素对还原糖生成量的影响次序为酶添加量>酶解时间>温度>pH值。最优条件是酶添加量为56%，温度为 52.32 ℃，酶解时间为12.46 h，pH值为6.36，此时还原糖生成量期望值为0.201 9 mg/mL。
　　2.3.3 响应曲面分析
　　采用软件Design-Expert获得响应值的3D曲面，分析各因素对还原糖生成量的影响及各因素间的交互作用，即當固定酶添加量、温度、酶解时间、pH值中任意2个因素为零水平时，其他2个因素间的交互作用对还原糖生成量的影响。从图8可以看出，还原糖生成量随其中任意2个因素量的增加均呈上升趋势，达到一定值之后，稍下降或趋于平缓。各因素之间具有交互作用。
　　2.3.4 验证与优化
　　通过响应面法优化XMP-1的最佳酶解条件，结合实际操作，将优化条件调整为酶添加量56%、温度52 ℃、酶解时间12 h、pH值 6.0，在此条件下进行试验，平行检测5次，所测的还原糖生成量为0.201 0 mg/mL，与期望值的相对误差在5%以内，二者较吻合。所以该方法能较好优化XMP-1的酶解条件，具有较好的可信度。
　　2.4 不同时间段酶解产物的体外免疫诱导活性
　　2.4.1 不同时间段的酶解产物对细胞的毒性作用
　　不同时间段的酶解产物分别孵育48 h后对RAW264.7细胞毒性作用见图9。通过光学显微镜观察XMP-1对RAW264.7细胞形态的影响，结果发现，XMP-1对RAW264.7细胞的形态没有造成明显的影响。XMP-1在31.250～500.000 μg/mL浓度范围内，孵育48 h后对细胞的生长不会造成明显影响。所以浓度在500.00 μg/mL以内的XMP-1对RAW264.7细胞是安全无毒性的，可以作为后续试验的浓度设定上限，这对于各项试验指标的判断都具有重要的意义。
　　2.4.2 不同时间段的酶解产物诱导RAW264.7细胞活化分泌TNF-α的结果
　　孵育24、36、48 h后，不同时间段的酶解产物对RAW264.7细胞分泌TNF-α的影响见图10。不同时间段的酶解产物均能诱导RAW264.7细胞活化分泌TNF-α，且诱导活性呈现浓度依赖性。酶解5 h的组分诱导RAW264.7细胞分泌TNF-α的作用，孵育36 h和48 h时不同浓度的诱导作用均强于多糖组。
　　2.4.3 不同时间段的酶解产物诱导RAW264.7细胞活化释放NO的结果
　　孵育24、36、48 h后，不同时间段的酶解产物诱导RAW264.7细胞活化释放NO的结果见图11。结果表明，XMP-1不同时间段的酶解产物均可有效诱导RAW264.7细胞活化分泌NO，孵育36、48 h时，酶解4、5 h的酶解产物在不同浓度条件下都能较好地促进细胞NO的分泌，且都优于多糖组。
　　3 讨论与结论
　　运用葡聚糖酶对XPM-1进行酶解，在单因素试验的基础上考察了XMP-1经葡聚糖酶酶解的最佳条件， 运用星点设计法构建了各酶解条件因素对XMP-1酶解工艺的影响模型，结果表明，该方法拟合程度较好，模型具有设计意义;酶添加量、酶解时间的适当增加以及适宜的pH值和温度都能增加还原糖的生成量;4因素对还原糖生成量的影响次序为酶添加量>酶解时间>温度>pH值。将优化条件修正为酶添加量为56%，温度为 52 ℃，酶解时间为12 h，pH值为6.0后，还原糖量生成量为 0.201 0 mg/mL，与期望值的相对误差在5%以内，可信度较高，可用于XMP-1酶解工艺的优化。体外免疫诱导活性分析结果表明， 浓度为 500 μg/mL 以下，孵育时间48 h以内，酶解产物对细胞没有明显的毒害作用;不同时间段酶解产物均可诱导细胞分泌TNF-α和NO，其中酶解5 h的组分免疫诱导活性较其他时间段效果好。本研究结果可为仙茅在食品和医药领域的开发利用及工艺化生产提供一定的理论指导。 　　參考文献：
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