假单胞菌增殖培养基中碳源氮源的优化

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　　摘要 [目的]提高假单胞菌的增殖，降低生产成本。[方法]采用光电比浊法，通过单因素试验对假单胞菌增殖培养基的碳源和氮源进行优化。[结果] 假单胞菌增殖培养基中最佳的碳源、氮源种类与浓度分别为蔗糖0.5 g/L、鱼蛋白胨1.2 g/L。[结论]通过对增殖培养基的优化，降低了生产成本。
　　关键词 假单胞菌;碳源;氮源;优化
　　中图分类号 Q93-33文献标识码 A
　　文章编号 0517-6611（2020）07-0083-02
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.07.025
　　Optimization of Carbon and Nitrogen Sources of Enrichment Medium for Pseudomonas
　　GONG Dafei1，2，LIAO Jingyun1，2，ZENG Huifan1，2 et al
　　（1.College of Life Science，Guangxi Normal University，Guilin，Guangxi 541006;2.Key Laboratory of Ecology and Environmental Protection of Rare and Pndangered Animals and Plants，Ministry of Education，Guilin，Guangxi 541006）
　　Abstract [Objective]To improve the proliferation of Pseudomonas and reduce the production cost.[Method] The photoelectric turbidimetry method was used to optimize the carbon and nitrogen sources of Pseudomonas enrichment medium by single factor test.[Result]The optimal carbon source and nitrogen source species and concentration in Pseudomonas enrichment medium were sucrose 0.5 g/L and fish protein 1.2 g/L，respectively. [Conclusion]By optimizing the enrichment medium，the production cost was reduced.
　　Key words Pseudomonas;Carbon source;Nitrogen source;Optimization
　　基金項目 广西高校中青年教师基础能力提升项目（2018KY0086）;广西师范大学博士科研启动基金项目（2017BQ015）;广西研究生教育创新计划项目（JGY2019009）。
　　作者简介 宫达非（1996—），女， 吉林四平人，硕士研究生，研究方向：微生物学与分子生物学;廖静云（1994—），女，广西来宾人，本科，专业：生物科学;曾慧帆（1997—），女，海南澄迈人，本科，专业：生物科学。宫达非、廖静云、曾慧帆为共同第一作者。通信作者，副教授，博士，硕士生导师，从事微生物学与分子生物学研究。
　　收稿日期 2019-08-15;修回日期 2019-09-20
　　假单胞菌属（Pseudomonas）隶属于薄壁菌门假单胞菌科，该属由Migula在1894年创立，包括200余种细菌[1]。它们大多为革兰氏阴性杆菌，形态上有直的和弯曲的，非常细小，有单鞭毛或多鞭毛，并以鞭毛运动，没有芽孢[2]。只能在有氧环境中生存，多分布于土壤、水体及植物体内，在pH 7.0～8.5的范围内生长。能在4～43 ℃下生长，生长温度范围广泛，但大部分菌的生长温度是30 ℃，分解有机物的能力很强，而且可将多种有机物作为能量来源[3-4]。
　　假单胞菌对紫外线、消毒剂等杀菌手段，都有较强的抵御能力。研究发现，在人体的皮肤、呼吸道和肠道等部位假单胞菌也普遍存在[5]。此外，假单胞菌在生物防治等方面起着非常重要的作用。它能产生植物生长所需要的调节物质和抗生素，降解有毒物质，促进植物进行营养生长;它能通过杀掉害虫而起到生物防治的作用;其模式种的耐药机制研究对医学发展有重要的指导意义[6]。 　　该研究选用的假单胞菌Cr13由该实验室对从河池市南丹县大厂镇矿区获得的重金属污染土壤进行平板筛选后获得，该菌株可以耐受高浓度的六价铬。为了降低假单胞菌的培养成本，促进该菌种的产业化生产，笔者通过单因素试验对菌株Cr13增殖培养基的碳源和氮源进行优化。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料 假单胞菌Cr13由珍稀濒危动植物生态与环境保护教育部重点实验室提供。培养假单胞菌所用的碳源（牛肉膏、葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麦芽糖、半乳糖和甘露糖）、氮源（蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨、鱼蛋白胨、酵母粉、L-色氨酸、酪蛋白氨基酸、硝酸铵、硝酸钾、脲）、NaCl及琼脂等均从广西卓一生物技术有限公司购买。
　　1.2 仪器 722型光栅分光光度计（上海市第三分析仪器厂）;LYZ-1102恒温摇床（上海龙跃仪器设备有限公司）;ZHJH-C1106B超净工作台（上海智城分析仪器制造有限公司）;MLS-3750高压蒸汽灭菌锅（三洋电机株式会社）;PH-18-FA1104分析天平（北京精测电子科技有限公司）。
　　1.3 方法
　　1.3.1 培養基。 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、蒸馏水1 000 mL，pH 7.4～7.6，115 ℃灭菌30 min备用。牛肉膏蛋白胨琼脂培养基：在牛肉膏蛋白胨培养基的基础上加入2%琼脂。
　　1.3.2 菌种活化。 取-70 ℃保存的菌种在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上划线，挑取单菌落接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，28 ℃培养24 h，作为种子液备用。
　　1.3.3 假单胞菌增殖培养基的优化。 以牛肉膏蛋白胨培养基作为基础培养基，1%接种量，28 ℃恒温培养，测定吸光度值。通过单因素试验对培养基中的碳源、氮源进行优化，确定最佳碳源、氮源的种类以及浓度。
　　（1）碳源优化。以牛肉膏蛋白胨培养基作为基础培养基，分别以相同浓度（0.3%）的葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麦芽糖、半乳糖和甘露糖替换牛肉膏，其他成分及含量保持不变，考察不同种类碳源对假单胞菌增殖的影响。再依据试验结果筛选最适宜的碳源种类，并对其进行碳源浓度优化试验。
　　（2）氮源优化。 以牛肉膏蛋白胨培养基作为基础培养基，分别以相同浓度（1%）的6种有机氮源（胰蛋白胨、酪蛋白胨、鱼蛋白胨、酵母粉、L-色氨酸、酪蛋白氨基酸）和3种无机氮源（硝酸铵、硝酸钾、脲）替换蛋白胨进行试验，其他成分及含量保持不变，考察相同浓度、不同种类的蛋白胨对假单胞菌增殖的影响。然后再依据试验结果筛选最适宜的氮源种类，考察氮源的不同浓度对假单胞菌增殖的影响。
　　1.3.4 光电比浊法测定生物量。接种后的增殖培养基于28 ℃恒温培养。到稳定期后菌液用培养基适当稀释，以相应的空白培养基（不接种菌）作为对照，利用分光光度计测定OD600值。以进入稳定期后的3个平行组求平均值，以此确定生物量。
　　2 结果与分析
　　2.1 不同种类碳源对假单胞菌的影响
　　碳源是一类可以影响假单胞菌生长繁殖及胞外多糖和抗生素等代谢产物合成的营养物质[7-8]，因此适宜的碳源种类有利于假单胞菌的生长繁殖。该研究表明，以蔗糖作为假单胞菌增殖培养基的碳源时，吸光度值最高，其次是牛肉膏和半乳糖（图1）。说明蔗糖对假单胞菌的生长繁殖有良好的效果，而且蔗糖的价格也很低。综合考虑，该研究将进一步考察不同蔗糖浓度对假单胞菌增殖的影响。
　　2.2 不同种类氮源对假单胞菌的影响
　　图2表明，除了L-色氨酸作为有机氮源时菌株生长较慢，其他有机氮源促进菌株生长的效果都优于无机氮源。其中，鱼蛋白胨作为氮源时培养假单胞菌的效果最好，吸光度值最高。其次是酵母粉与酪蛋白胨，而且鱼蛋白胨的价格也很低。综合考虑，该研究将进一步考察鱼蛋白胨的不同浓度对假单胞菌增殖的影响。
　　2.3 不同浓度的碳源对假单胞菌的影响 采用单因素试验考察碳源蔗糖的最佳浓度。结果表明，当蔗糖浓度在0.5～3.5 g/L的范围内变动时，蔗糖浓度的增大对假单胞菌生长的影响并不显著（图3）。综合考虑成本因素，选择0.5 g/L为蔗糖最适浓度。
　　2.4 不同浓度的氮源对假单胞菌的影响 采用单因素试验考察氮源与蛋白胨的最佳浓度。结果表明，不同浓度鱼蛋白胨对假单胞菌生长的影响比较显著，但当鱼蛋白胨浓度达到1.2 g/L后，浓度继续增大对假单胞菌生长的影响并不显著（图4）。综合考虑成本因素，选择1.2 g/L为鱼蛋白胨最适浓度。
　　3 讨论
　　该研究发现，用蔗糖作为碳源时，培养假单胞菌Cr13的效果最为明显，其次是半乳糖和可溶性淀粉。但是葡萄糖对假单胞菌Cr13生长的效果就较差，这与孙承文等[9]、郭丛等[10]的研究中以葡萄糖作为碳源时对假单胞菌生长影响显著的试验结果不同，该研究确定的最适碳源蔗糖与王宇等[11]、谯天敏等[12]等所得的最适碳源一致，表明不同的假单胞菌菌株其最适碳源种类差别较大。
　　该研究表明，假单胞菌Cr13对不同种类氮源具有偏好性，有机氮源明显优于无机氮源，这可能是因为有机氮源除了可以提供氮源外，还含有丰富的氨基酸和维生素等物质，为假单胞菌Cr13的繁殖提供了有利的条件[13]。
　　参考文献
　　[1] 海碧.甘蔗根际假单胞菌的分离鉴定及其对甘蔗的促生作用[D].南宁：广西大学，2017. 　　[2] 吉振兴.ESBR反应器中耐冷菌的分离鉴定和低温生物强化运行研究[D].哈尔滨：哈尔滨工业大学，2006.
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　　[4] 向照举，李小璐，李治.假单胞菌属合成环脂肽分子的研究进展[J].中国生物制品学杂志，2014，27（7）：974-980.
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　　[6] 杨光富，魏云林.假单胞菌研究现状及应用前景[J].生物技术通报，2011（1）：37-39，49.
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　　[8] 张燕，张阳，张博，等.不同碳源对生防荧光假单胞菌2P24产抗生素2，4-二乙酰基间苯三酚的影响[J].微生物学报，2018，58（7）：1202-1212.
　　[9] 孫承文，赖迎迢，任小波，等.草鱼铜绿假单胞菌灭活疫苗发酵培养基的优化及其在发酵罐的生长试验[J].大连海洋大学学报，2019，34（1）：15-20.
　　[10] 郭丛，杨金广，翟熙伦，等.恶臭假单胞菌发酵条件的研究[J].中国烟草科学，2013，34（4）：50-54，59.
　　[11] 王宇，吴洪槟，刘松鑫，等.降解胆固醇的假单胞菌DGC-2的发酵培养基和培养条件[J].信阳师范学院学报（自然科学版），2012，25（4）：465-468.
　　[12] 谯天敏，张静，赵芳，等.铜绿假单胞菌发酵条件优化及抗菌物质研究[J].南京林业大学学报（自然科学版），2014，38（5）：45-50.
　　[13] 朱丹凤，王园园，崔树茂，等.罗伊氏乳杆菌氮源利用的选择性与特征分析[J].食品与发酵工业，2018，44（11）：35-41.
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