澳洲石斛花粉离体萌发液体培养基研究

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　　摘要：以澳洲石斛（Dendrobium kingianum）新鲜花粉为试验材料，在单因素试验基础上，设计正交试验，比较蔗糖、H3BO3、CaCl2对澳洲石斛花粉萌发的影响，旨在筛选出适合澳洲石斛花粉离体萌发的液体培养基配比，为澳洲石斛花粉离体培养及杂交育种提供参考依据。结果表明，单因素试验中，在一定浓度范围内的蔗糖、H3BO3、CaCl2，对澳洲石斛花粉萌发具有一定促进作用，超过一定浓度则起抑制作用;正交试验中，蔗糖、H3BO3和CaCl2对澳洲石斛花粉萌发的影响都极显著，适宜的花粉离体萌发培养液为10 g/L蔗糖+40 mg/L H3BO3+30 mg/L CaCl2，花粉萌发率为37.02%。
　　关键词：澳洲石斛;花粉;离体萌发;液体培养基
　　中图分类号： S682.310.4+3文献标志码： A
　　文章编号：1002-1302（2020）08-0149-04
　　收稿日期：2019-03-29
　　基金项目：福建省福州市园林局2014年度绿化专项科研项目（编号：201404）。
　　作者简介：夏春英（1996—），女，福建三明人，硕士研究生，从事花卉与景观园艺研究。E-mail：1144179784@qq.com。
　　通信作者：郑诚乐，博士，教授，从事果树栽培生理与生化、花卉与景观园艺、设施园艺等研究。E-mail：zcl2003@126.com。
　　澳洲石斛（Dendrobium kingianum）是兰科石斛属植物，原产于澳大利亚，生長在阔叶林的树干上，为附生兰。澳洲石斛植株较小，其叶茎特殊，具有根茎、直立、匍伏或具假球茎等生育形式，上部略呈回折状，类似竹节，呈黄绿色[1];叶着生于近茎顶，2～4张叶，一般为椭圆形，与竹叶形似;花葶从叶腋抽出，花簇生，花径2～3 cm，萼片及花瓣为紫红色，唇瓣前端带有紫色条斑，瓣心泛白[2]。石斛兰是兰科石斛属的总称，与卡特兰、蝴蝶兰、文心兰同为世界四大观赏洋兰[3]。随着人们对观赏石斛消费需求的扩大，观赏石斛的育种及其杂交新品种的研究越来越受关注[4]。澳洲石斛花色鲜艳，可切花观赏，在兰花爱好者中颇受欢迎，相关的学术研究也逐渐开展，其中，培育品种是最首要的一个方面。
　　花粉作为雄配子体，其质量和生活力是保证受精成功所必备的条件之一，在杂交育种工作中，具有较高生活力的花粉是确保杂交成功的关键，其地位举足轻重[5-7]。兰科植物的花粉块状结构为四分体，从而降低了花粉离体萌发的速率，液体培养时，在培养前将花粉加以浸泡研磨，不仅可以提高试验效率还可提高花粉的萌发率[8]。澳洲石斛是石斛兰中的一个新兴品种，目前，国内外关于澳洲石斛的相关研究报道还比较少见。因此，本研究在前人研究的基础上，以澳洲石斛的花粉为试验材料，采用液体培养法，研究了不同蔗糖、H3BO3、CaCl2浓度及其正交组合对花粉萌发的影响，以期为澳洲石斛花粉生活力测定提供技术参考与试验方法，进而为其杂交育种和繁殖生物学的深入研究提供基础资料。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　本试验于2018年1—5月进行，材料为栽培于福建省福州市于山风景区兰花圃内的澳洲石斛，所用花粉取自澳洲石斛盛花期当天开放的新鲜花朵，09：30—10：30采集花粉（图1右第4朵花的花粉）。
　　1.2 方法
　　1.2.1 单因素试验
　　在澳洲石斛盛花期，于晴天的09：30—10：30采集澳洲石斛当天开放的花朵于滤纸上，迅速转至实验室条件进行下一步试验操作。采用液体培养法，首先进行单因素试验设计，分别对蔗糖、H3BO3和CaCl2这3个培养基组分进行研究，并作如下质量浓度梯度设置，即蔗糖为1、5、10、20、30、40、50、60 g/L，H3BO3为10、20、30、40、50、60、70、80 mg/L，CaCl2为1、5、10、20、30、40、50、60 mg/L，各设置8个质量浓度梯度，并正确配制相应的液体培养基。将配制好的培养液每种取3 mL加入离心管， 然后把适量花粉团装入离心管中并用
　　镊子轻轻摩擦花粉团使花粉粒均匀分散于培养液中，在26 ℃恒温箱中暗培养。培养36 h后取数个样进行花粉萌发情况预观测，培养至48 h后，将培养的花粉从恒温箱中全部取出，用胶头滴管取适量培养液于载玻片上，盖上盖玻片，在生物显微镜4倍镜下镜检，每次观测时随机选取10个视野，排除畸形花粉后，统计花粉萌发情况。试验重复3次，以花粉管长度大于花粉粒直径为标准。
　　花粉萌发率=萌发花粉数/花粉总数×100%。
　　1.2.2 正交试验设计
　　在单因素试验的基础上，选择在单因素试验中对澳洲石斛花粉离体萌发影响较大的蔗糖、H3BO3和CaCl2的4个质量浓度水平，采用L25（53）正交试验设计，每个组合重复3次，以确定培养基不同组分的最佳配比，培养与检测方法同“1.2.1”节。
　　1.3 数据处理
　　所测数据用Excel 2010和SPSS 19.0软件进行统计分析。在处理正交试验原始数据时，如果服从二项分布的百分率资料中有小于30%或大于70%的百分率，则应对资料中全部百分率数据进行反正弦转换，然后再进行方差分析[9]。因此，由于本试验中有许多小于30%的百分率数据，所以先对数据进行反正弦函数转换，再用转换后的数据进行SPSS方差分析，反正弦函数公式为x=arcsinP（其中，P为萌发率百分数）。
　　2 结果与分析
　　2.1 不同培养基组分对澳洲石斛花粉离体萌发的影响
　　由表1可知，随着蔗糖、H3BO3、CaCl2这3个单因素培养基组分的质量浓度变化，花粉萌发率均呈现先上升后下降的趋势。通过Excel和SPSS软件对原始数据处理的结果来看，在单因素方差分析和多重比较中，蔗糖对澳洲石斛花粉萌发率的影响最明显，当其质量浓度为10 mg/L时，萌发率与其他组均有显著差异，萌发率为最大值17.19%;当H3BO3质量浓度为30 mg/L时，花粉萌发率最高，为1331%;CaCl2质量浓度为30 mg/L时，花粉萌发率最高，为5.13%。 　　2.2 最适培养基筛选
　　选择在单因素试验中对澳洲石斛花粉离体萌发影响较大的蔗糖、H3BO3和CaCl2的4个质量浓度水平，采用L25（53）正交试验设计，寻找3因子的最佳配比（表2）。对该正交试验反正弦函数转换后的数据做方差分析，其中，主体间效应检验结果表明，蔗糖、H3BO3和CaCl2这3个因素对花粉萌发都有极显著影响;正交方差分析的多重比较结果显示，蔗糖30 g/L、H3BO3 60 mg/L、CaCl2 30 mg/L时的花粉萌发率与其他组合存在显著差异，此组合在正交试验中编号为25，萌发率为22.52%。进一步分析，花粉萌发率平方和最高值的组合为10 g/L蔗糖+40 mg/L H3BO3+30 mg/L CaCl2，此组合在正交试验中编号为14，萌发率最高，为37.02%，且与其他组合存在显著差异（P<0.05），优于编号25的组合。综合单因素试验及正交试验结果的方差分析和比较，得出澳洲石斛的最适培养基组合为 10 g/L 蔗糖+40 mg/L H3BO3+30 mg/L CaCl2。
　　正交试验培养36 h后取部分样进行花粉萌发情况预观测，培养48 h后，在4倍显微镜下其萌发情况见图2。
　　3 讨论与结论
　　由于兰科植物的花粉是4个花粉块黏结组成的花粉团，花粉团外面包裹着类脂膜，这使得花粉萌发的速度降低，往往在研磨浸泡时也不能完全排除黏连物质对花粉萌发的影响[10]。因此本研究采用液体培养法，来提高试验效率和花粉萌发率。其次，多数研究都发现蔗糖、H3BO3和CaCl2对兰科植物花粉的萌发起关键作用，因此本试验将蔗糖、H3BO3和CaCl2作为花粉离体萌发主要的培养基成分。
　　蔗糖在花粉萌发过程中，不仅作为重要的能源物质为花粉萌发提供营养，并且作为渗透物质为花粉萌发和生长起到调节渗透压的作用，恰到好处的蔗糖质量浓度可以维持好花粉和培养基间的渗透压，在一定程度上缓解花粉破裂，但若质量浓度过高或者过低，对花粉的萌发生长不仅没有促进作用，在质量浓度过高时还会造成原生质脱水，反而抑制了萌发[11-13]。在本试验中，蔗糖不是澳洲石斛花粉离体萌发所必需的成分，这一结果与杂种卡特兰（Cattleya hybrida）[14]、聚石斛（Dendrobium lindleyi）[15]相同，用蒸馏水培养就可使其萌发，但萌发率较低，本试验结果为3.39%。其原因可能是花粉自身含有的营养物质能够满足花粉萌发的需求[16]。本研究结果表明，蔗糖质量浓度以10 g/L为澳洲石斛花粉离体萌发的最适质量浓度，此结果低于杂种卡特兰[14]、聚石斛[15]、白芨[17]、无距虾脊兰（Calanthe tsoongiana）[6]、大花蕙兰[18]的最适萌发蔗糖质量浓度。
　　单因素试验中，H3BO3质量浓度为20、30、40 mg/L 下培养的花粉萌发率与其他组存在明显差异，分别为11.06%、13.31%、12.17%，且三者间无明显差异;正交试验的方差分析显示H3BO3与其他2个组分对澳洲石斛花粉萌发的影响都是极显著的（P<0.01），且在质量浓度为40 mg/L时的组合花粉萌发率最高。综合单因素和正交试验结果，澳洲石斛花粉萌发的H3BO3最适质量浓度为40 mg/L。虽然H3BO3在植物组织中含量很低[19]，但是H3BO3能与蔗糖形成络合物，促进了糖的吸收、转运与代谢，提高花粉的萌发率。此外，H3BO3还参与果胶的合成，促进花粉管壁的形成[20]，大大增加了花粉管生长的长度。
　　相关研究表明，花粉的离体萌发还需要从培养基中吸收大量钙离子，降低培养基中的钙离子质量浓度会明显抑制花粉萌发，并且外源钙可以替代花粉萌发时的群体效应[21]，因此，适宜的钙离子质量浓度是花粉体外萌发所必需的[22]。本研究结果表明，CaCl2在单因素试验中作用不是很明显，在最适质量浓度 30 mg/L 时花粉萌发率为5.13%;但与蔗糖和H3BO3组合时，能起到交互作用，促进花粉萌发，在30 mg/L時萌发率最高。究其原因，花粉萌发时不需要外源Ca2+并不表明就不需要Ca2+的参与，很有可能是不同品种花粉自身释放的Ca2+含量不一样，花粉大多储存在花粉壁中，当在液体培养液中培养时，花粉水合释放自身Ca2+，有的品种花粉自身所含Ca2+就足以满足生长发育所需，故而对外源Ca2+表现为非必需[23]。因此，澳洲石斛正交试验时，30 mg/L CaCl2与蔗糖和H3BO3组合起促进作用的确切机制还有待进一步探讨。
　　本研究综合单因素试验及正交试验结果的方差分析和比较，得出澳洲石斛的最适培养基组合为10 g/L蔗糖+40 mg/L H3BO3+30 mg/L CaCl2。影响植物花粉萌发的因素有很多，不同的植物种类花粉萌发所需要的蔗糖、H3BO3、CaCl2的最适质量浓度都不完全一致[24]，且不同的培养条件下，花粉的萌发情况也各不相同，本试验仅对同一培养条件下的不同培养液组分进行了研究，关于澳洲石斛的最适培养条件还待进一步探讨，本试验结果仅供后续的深入研究作参考。
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