三萜纤细薯蓣皂苷对人肝癌HepG2细胞的抑制作用研究
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【摘要】目的 探讨属于三萜类化合物的纤细薯蓣皂苷对人肝癌HepG2细胞生物学功能的影响及潜在临床应用价值。方法 采用CCK8试剂盒检测纤细薯蓣皂苷对HepG2细胞活性的影响，流式细胞仪检测细胞凋亡，蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白的表达变化。结果 HepG2细胞的细胞活性随着纤细薯蓣皂苷的浓度升高而降低;纤细薯蓣皂苷在逐渐增加的浓度下处理HepG2细胞，随着纤细薯蓣皂苷浓度的升高，HepG2细胞的总凋亡率逐渐增加;与经DMSO溶剂处理的对照组细胞相比，经纤细薯蓣皂苷处理后的HepG2细胞内PARP蛋白切割，caspase 3激活和BCL2表达水平降低。结论 纤细薯蓣皂苷可能通过下调BCL2蛋白表达抑制HepG2细胞的增殖和诱导凋亡。
【关键词】纤细薯蓣皂苷;肝癌HepG2细胞;细胞凋亡;BCL2
【中图分类号】R735.7 【文献标识码】A 【文章编号】ISSN.2095.6681.2020.1..02
原发性肝癌由于其起病隐匿，早期症状不明显且发展迅速，致使确诊时在大多数患者体内已发生远端转移，使得治疗难度增加，预后性差，这导致肝癌成为致死率最高的恶性肿瘤之一[1]。随着近些年分离纯化和化学合成技术的发展，许多具有抗癌活性的天然小分子化合物得以被分离或合成。纤细薯蓣皂苷是一种三萜类化合物，在薯蓣科植物中含量较为丰富[2]。既往研究已报道薯蓣皂苷及其衍生物具有抗肿瘤活性[2-4]，但目前相关研究仍较少，且其对肝癌细胞生物学功能影响及价值仍不清楚。本研究以纤细薯蓣皂苷作用于人肝癌细胞系HepG2，探讨其对肝癌细胞的细胞增殖和细胞凋亡的作用，并通过蛋白质印迹法检测与细胞凋亡相关的蛋白表达，为纤细薯蓣皂苷抑制肝癌分子机制和临床价值的研究提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 细胞株及主要试剂
来源于人的肝癌细胞株HepG2购买于中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所;CCK-8试剂盒购买于MedChem Express公司;凋亡试剂盒购买于南京诺唯赞生物科技有限公司;各种蛋白抗体均购买于Cell Signaling Technology公司;纤细薯蓣皂苷购买于美国Target Molecule公司。
1.2 CCK-8法检测细胞存活率实验
将处于对数生长期且细胞状态良好的HepG2细胞，以3×104个/mL的密度，100L/孔接种于96孔细胞培养板中过夜培养24 h。纤细薯蓣皂苷实验组分别加入100L溶于MEM培养液的终浓度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10mol/L的纤细薯蓣皂苷溶液，对照组加入100 L与实验组依次对应等DMSO浓度的MEM溶液，每组均设3个复孔，培养48h后，每孔加入10 L CCK-8溶液，另取三个孔不铺细胞，只加100L MEM培养液和10L CCK-8溶液作为空白对照，在培养箱中孵育3h，用酶标仪检测426nM处的吸光度，计算细胞存活率。
细胞存活率=[（A纤细薯蓣皂苷实验组-A空白对照组平均值） / （ADMSO对照组平均值-A空白对照组平均值）] × 100%。
1.3 流式细胞仪检测细胞凋亡
将HepG2细胞以3×106个/mL的密度，1.5 mL/孔接种于6孔细胞培养板中过夜培养24h。纤细薯蓣皂苷实验组分别加入溶于MEM培养液的终浓度为5、7.5、10、15、20mol/L的纤细薯蓣皂苷溶液，对照组加入与20 mol/L的纤细薯蓣皂苷溶液等DMSO浓度的MEM溶液，处理24 h后收集细胞，将细胞重悬于100 L 1×Binding Buffer，并加入5 L Annexin V-FITC和5 L PI Staining Solution，轻轻吹匀至单细胞悬液，室温、避光，孵育10 min后加入400 L 1×Binding Buffer，轻轻混匀。染色后样品在1 h内用流式细胞仪在488 nm和530 nm激发波长下进行检测。晚期凋亡细胞数与总细胞数的比值为细胞晚期凋亡率。实验重复4次。
1.4 Western blot检测蛋白表达
将HepG2细胞以3×105个/mL的密度，3 mL/板接种于6 cm细胞培养板中过夜培养24bh。实验組用溶于MEM培养液的终浓度为5、10 mol/L的纤细薯蓣皂苷溶液，对照组加入与10 mol/L的纤细薯蓣皂苷溶液等DMSO比例的MEM溶液，处理24 h后收集细胞，加入细胞裂解液裂解细胞，收集蛋白。采用Bradford法鉴定蛋白浓度，取20 ug蛋白上样，经SDS-PAGE，转膜后用5%脱脂牛奶封闭2 h。分别用抗体PARP、cleaved PARP、caspase 3、GAPDH、BCL2进行4°C过夜孵育。用TBST洗膜3次，再加入二抗，室温孵育1h。用TBST洗膜4次。膜经ECL超敏发光液显色后进行成像。
1.5 统计学分析
采用GraphPad Prism 8进行统计学分析，实验数据以“x±s”表示。以P<0.05为有统计学差异。
2 结 果
2.1 纤细薯蓣皂苷对 HepG2 细胞增殖的影响
纤细薯蓣皂苷在3mol/L时对HepG2的生长有明显抑制作用。随着纤细薯蓣皂苷浓度的增加，HepG2细胞活力逐渐降低，呈现明显的浓度与抑制率正相关性，其IC50为4.105M。见图一。
2.2 纤细薯蓣皂苷诱导HepG2细胞凋亡
随着纤细薯蓣皂苷处理的浓度的升高，使HepG2发生晚期凋亡的细胞比例也逐渐上升。HepG2细胞在5、7.5、10、15和20 mol/L纤细薯蓣皂苷处理24 h后，晚期凋亡率分别为（3.1925%±0.156）%、（10.525%±0.287）%、（31.65%±0.420）%、（62.325%±1.282）%和（72.725%±1.903）%。见图二。 2.3 PARP、cleaved PARP、caspase 3、BCL2蛋白水平的变化
Western blot结果显示，与对照组相比，HepG2细胞在10 mol/L纤细薯蓣皂苷处理24 h后，细胞内PARP蛋白水平下降，cleaved PARP蛋白水平升高说明PARP蛋白在体内被切割;caspase 3和BCL2蛋白水平均有下降，说明药物诱导肝癌细胞发生了凋亡。见图三。
3 讨 论
纤细薯蓣皂苷是一类在薯蓣科植物中含量丰富的薯蓣皂苷类化合物。前人曾报道薯蓣皂苷及其类似物对部分肿瘤细胞有抑制作用[5]，但其对肝癌细胞生物学功能影响尚不清楚。本研究针对纤细薯蓣皂苷，探究了其对人肝癌细胞的促凋亡作用及其分子机制。
BCL2家族包括抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白，在调节细胞凋亡中有重要作用。其中BCL2属于BCL2家族中的抗凋亡蛋白，其定位于细胞核膜、内质网膜和线粒体外膜上，直接影响线粒体膜功能。BCL2可通过BH3结构域与同家族的促凋亡蛋白结合，从而形成异源二聚体，以此维持促凋亡蛋白在细胞内的定位分布。若BCL2蛋白的含量相对下降，BCL2家族的促凋亡蛋白将移位到线粒体膜上，刺激线粒体释放促凋亡因子，激活caspase级联反应，诱导细胞凋亡[6， 7]。Caspase 3作为caspase级联反应下游最关键的凋亡执行者之一，活化后的caspase 3能切割PARP蛋白，从而影响DNA的复制及损伤修复[8]。
本研究结果表明，与对照组相比，经过纤细薯蓣皂苷处理后，HepG2细胞内的BCL2蛋白含量相对减少，说明纤细薯蓣皂苷很可能直接或者间接的作用于BCL2蛋白上导致其蛋白表达的下降，从而激活caspase级联反应。Caspase 3蛋白水平的下降，表明有caspase 3 被切割而激活，同时，PARP蛋白也被切割，这些现象说明caspase级联反应已进行到了效应阶段。随着纤细薯蓣皂苷处理浓度的升高，HepG2细胞的存活率逐渐下降，发生晚期凋亡的细胞占比也在升高，说明纤细薯蓣皂苷能抑制人肝癌HepG2细胞的增殖并诱导其发生凋亡。
综上所述，纤细薯蓣皂苷表现出的抗肿瘤活性，使其可能作为抗肿瘤药物的主要成分而被开发利用，有望为肝癌的临床治疗提供新的方法。
参考文献
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[7] 杨连君.bcl-2，bax与肿瘤细胞凋亡[J].中国肿瘤生物治疗杂志，2003，（03）：232-4.
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本文编辑：李 豆
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