竹节参中皂苷含量测定方法的建立

来源:用户上传      作者:徐怡 张晓南 苏钛 冉远克 游燕

　　摘要：目的 建立高效液相色谱法（HPLC）测定竹节参中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Ro、竹节参皂苷Ⅳa含量的方法。方法：色谱柱：Waters Symmetry C18 柱（5 μm，4.6×250 mm）;流动相：乙腈-0.2%磷酸溶液;流速：1.0 mL/min;检测波长：203 nm。结果 人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Ro、竹节参皂苷Ⅳa的线性范围分别为0.01753ug-1.7531ug（r=1）、0.01754ug-1.7541ug（r=1）、0.04917ug-4.917ug（r=1）、0.0248751ug-0.99486ug（r=1），平均回收率分别为94.68%（RSD=2.45%）、94.71%（RSD=2.82%）、97.92%（RSD=2.08%）、94.80%（RSD=2.41%）。结论 该方法简便可行，重复性好，可用于测定竹节参中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Ro;竹節参皂苷Ⅳa的含量，为进一步提高竹节参的质量控制提供依据。
　　关键词：高效液相色谱法;竹节参;竹节参皂苷;含量测定。
　　中图分类号：R927.2   文献标志码：A   文章编号：1007-2349（2020）01-0067-05
　　【Abstract】Objective： To establish a method for the determination of ginsenoside Rg1， ginsenoside Re， ginsenoside Ro， and ginsenoside IVa in Panax japonicas by HPLC. Methods： Chromatographic column was Waters Symmetry C18 column （5 μm， 4.6 × 250 mm）， mobile phase was acetonitrile-0.2% phosphoric acid solution， flow rate was 1.0 mL/min and detection wavelength was 203 nm. Results： The linear ranges of ginsenoside Rg1， ginsenoside Re， ginsenoside Ro， and Panax japonicas ginsenoside IVa were 0.01753ug-1.7531ug （r=1）， 0.01754ug-1.7541ug （r=1）， 0.04917ug-4.917. ug （r=1） and 0.0248751ug-0.99486ug （r=1） respectively. The average recovery rates were 94.68% （RSD=2.45%）， 94.71% （RSD=2.82%）， 97.92% （RSD =2.08%） and 94.80% （RSD=2.41%） respectively. Conclusion： The method is simple， feasible and reproducible and can be used to determine the content of ginsenoside Rg1， ginsenoside Re and ginsenoside Ro in Panax japonicas. The content of saponin Iva in Panax japonicas provides a basis for further improvement of the quality control of Panax japonicas.
　　【Key words】HPLC， Panax japonicas， Panax japonicas saponin， content determination.
　　竹节参收载于1975年及以后历版《中华人民共和国药典》，但迄今为止尚未建立含量测定的质量标准。竹节参为五加科植物竹节参（Panax japonicus C·A.Mey）的干燥根茎，以根状茎和肉质根入药，秋季采挖，除去主根及外皮，干燥，其根状茎称“竹节参”，块根称“明七”或“白三七”，叶称“七叶子”。主产于云南、贵州、四川、湖北等省，具有滋补强壮、止血祛痰、消肿镇痛、免疫调节、抗心肌缺血及降血糖等功效。
　　笔者参考《中国药典》以及相关文献中对竹节参皂苷成分的研究[1～6]，建立了以人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Ro、竹节参皂苷Ⅳa的方法学研究，本实验采用高效液相色谱法（HPLC）对竹节参中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Ro、竹节参皂苷Ⅳa的含量进行测定，为评价竹节参质量及进一步研究提供一定依据，具有重要意义。
　　1 实验部分
　　1.1 仪器与试药
　　1.1.1 仪器 美国Waters e2695高效液相色谱仪;美国Agilent 1260高效液相色谱仪;SK8200HP型超声波仪（上海科导）;AG285型电子天平（梅特勒-托利多）。
　　1.1.2 试药 三批竹节参由云南白药集团有限公司提供;对照品人参皂苷 Rg1（批号：110703-201832，纯度 92.4%）、人参皂苷 Re（批号：110754-201827，纯度93.4%）、人参皂苷 Ro（批号：111903-201604，纯度99.9%）、竹节参皂苷Ⅳa批号：111861-201001，纯度81.2%）均由中国食品药品检定研究院提供;所用流动相乙腈，磷酸为色谱纯，处理样品的甲醇为分析纯，水为超纯水。
　　1.2 方法与结果
　　1.2.2 溶液的制备 　　1.2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取对照品适量，加甲醇制成每1 mL中分别含人参皂苷Rg1 1.7531 mg，人参皂苷Re 1.7541 mg，人参皂苷Ro 1.639 mg，竹节参皂苷Ⅳa1.6581 mg的混合溶液，作为对照品溶液。
　　1.2.2.2 供试品溶液的制备 取装量差异项下的本品内容物，混匀，过二号筛，取0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加60%乙醇溶液25 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率25 kHz）40 min，放冷，再称定重量，以60%乙醇溶液补足减失重量，摇匀，0.45 μm滤膜滤过，取续滤液即得。
　　1.2.1 色谱条件 色谱柱：Waters Symmetry C18 柱（5 μm，4.6×250 mm）;流动相：以乙腈-0.2%磷酸溶液进行梯度洗脱，如下表;流速：1.0 mL/min;检测波长：203nm;进样量：10 μL;柱温在没有特殊說明的情况下均为25℃，在该色谱条件下，供试品、对照品分离较好，与其他杂质峰均能达到基线分离。
　　1.2.2 测定法 精密吸取上述溶液10 μL，注入液相色谱仪测定峰面积，以外标法计算，即得。
　　1.3 分析方法学考察
　　1.3.1 系统适应性试验 按供试品溶液制备方法制备供试品溶液按上述色谱条件分别进样对照品、供试品各10 μL。结果见图1。由图谱可以看出供试品溶液色谱中与对照品溶液色谱相应的位置上有相同的色谱峰出现，表明竹节参中其他成分对竹节参中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Ro、竹节参皂苷Ⅳa含量的的含量测定无干扰。
　　（1-人参皂苷Rg1，2-人参皂苷Re，3-人参皂苷Ro，4-竹节参皂苷Ⅳa）1.3.2 线性关系考察 分别精密称取人参皂苷 Rg1（批号：110703-201832，纯度 92.4%）16.20mg，人参皂苷 Re（批号：110754-201827，纯度93.4%）16.38 mg，人参皂苷 Ro（批号：111903-201604，纯度99.9%）16.37 mg，竹节参皂苷Ⅳa（批号：111861-201001，纯度81.2%）13.46mg置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制得对照品储备液（其中人参皂苷Rg11.7531 mg/mL、人参皂苷Re1.7541 mg/mL、人参皂苷Ro1.639 mg/mL、竹节参皂苷Ⅳa1.6581mg/mL），精密吸取混合对照品储备液，逐级稀释，按2.2.1项色谱条件进样，进样量10 μL，记录峰面积，测得结果见表2。以含量（X）对峰面积（Y）进行线性回归，得人参皂苷 Rg1回归方程：Y=3654124.82X+4367.50，相关系数r=1，Re回归方程：Y=2859651X+4135.96，相关系数r=1，Ro回归方程：Y=5816517.24X+1091.14，相关系数r=1，竹节参皂苷Ⅳa回归方程：Y=6867147.66X+4204.46，相关系数r=1。
　　结果表明，在上述色谱条件下，人参皂苷Rg1在0.01753ug-1.7531ug（r=1）范围内，人参皂苷Re在0.01754ug-1.7541ug（r=1）范围内，人参皂苷Ro在0.0248751ug-0.99486ug（r=1）范围内，竹节参皂苷Ⅳa在0.04917ug-4.917ug（r=1）范围内均呈良好的线性关系。
　　1.3.3 准确度试验（加样回收试验）
　　1.3.3.1 对照品溶液制备 精密称取人参皂苷 Rg1（批号：110703-201832，纯度 92.4%）、人参皂苷 Re（批号：110754-201827，纯度93.4%）、人参皂苷 Ro（批号：111903-201604，纯度99.9%）、竹节参皂苷Ⅳa批号：111861-201001，纯度81.2%）适量，至10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，得浓度为人参皂苷 Rg11.7531 mg/mL，人参皂苷Re1.7541 mg/mL，人参皂苷Ro1.639 mg/mL，竹节参皂Iva1.6581 mg/mL的对照品混合溶液，备用。
　　1.3.3.2 加样回收方法 精密称取9份供试品（批号：云南竹节参，已测人参皂苷 Rg1含量为0.295%，人参皂苷 Re含量为0.423%，人参皂苷 Ro含量为3.067%，竹节参皂苷Ⅳa含量为0.303%。每份约0.05 g，分别以50%、100%、150%加入上述对照品溶液，然后按供试品溶液处理方法同法处理，将处理好的溶液按含量测定方法同法测定，计算回收率，结果见表2。人参皂苷Rg1回收率为91.94%～98.11%，人参皂苷Re回收率为91.66%～99.23%，竹节参皂苷Ⅳa回收率为90.29%～98.83%（要求均为90%～108%），人参皂苷Ro回收率为95.11%～101.47%（要求为92%～105%），满足加样回收率的要求，说明方法准确度良好。
　　1.3.4 精密度试验
　　1.3.4.1 仪器精密度 取配制好的混合对照品溶液（人参皂苷Rg1 0.01753 mg/mL、人参皂苷Re 0.01754 mg/mL，人参皂苷Ro 0.04917 mg/mL，竹节参皂苷Ⅳa 0.0258715 mg/mL），按“2.2.1”项色谱条件进样，进样量10 μL，连续进样6针，保留时间及峰面积的RSD值均小于2%，结果表明本法具有良好的仪器精密度。
　　1.3.4.2 重复性试验 精密称取同一批号（批号：云南竹节参）的样品6份，按供试品溶液制备方法测定。计算得RSD均小于3%，结果表明本法具有良好的重复性，见表3。
　　1.3.5 耐用性试验 在耐用性的考察中对如下可能变动的因素做了考察。
　　1.3.5.1 柱温变化 取同一供试品溶液，在不同柱温下检测，可以看到温度变化在±5℃的情况下，对检测结果没有影响。 　　1.3.5.2 稳定性试验 取已配制好的供试品溶液按照含量测定方法依法测定，分别于0、2、4、8、12h进样，以峰面积计算，结果RSD均小于3%，说明样品在12 h内是稳定的。
　　1.3.6 样品测定 取3批样品按上述供试品制备方法制备，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录峰面积，以外标法计算样品中盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱的含量，结果见表4。
　　2 试验讨论
　　2.1 样品前处理方法的选择 提取溶剂的选择本试验参照2015版《中国药典》三七项、珠子参项及文献，分别考察了采用甲醇、乙醇、60%乙醇直接提取的方法，精密称定本品0.1 g，置锥形瓶中，分别精密加甲醇25 mL、乙醇25 mL、60%乙醇25 mL，称定重量，超声40 min，放冷后加甲醇、乙醇、60%乙醇补重，摇匀，用0.45μm滤膜滤过。取上述供试液10 μL进样，计算含量，结果表明60%乙醇提取较为完全，所以确定提取溶剂为60%乙醇。
　　提取方法的选择：考察了超声，回流二种方法，结果表明超声，回流都能有效提取完全，但考虑操作的简便以及试验误差，故确定超声提取法为提取方法。
　　提取时间的选择：精密称定本品0.1 g，置锥形瓶中，精密加60%乙醇25 mL，称定重量，分别超声提取20 min，40 min，60 min，放冷后加60%乙醇补重，摇匀，用0.45μm滤膜滤过。取上述供试液10 μL进样，计算含量，结果表明超声40 min已提取较为完全，所以确定提取时间为40 min。
　　2.2 试验小结 本试验建立了高效液相色谱同时测定竹节参中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Ro、竹节参皂苷Ⅳa的方法。从含量测定试验结果可以看出该方法的专属性、重复性、中间精密度、仪器精密度、线性、加样回收率、范围试验等均符合高效液相色谱法对含量测定方法的要求，可以用于竹节参皂苷的含量测定，为今后质量控制提供了参考。
　　试验对三批不同地区的竹节参进行了测定。从试验结果看，人参皂苷Ro是竹节参皂苷的主要成分，其余人参皂苷Rg1、Re、竹节参皂苷Ⅳa等皂苷所占比例均不高。云南、湖北、四川地區竹节参中皂苷比例相似，不同地区间的含量有所差别，但是否与地区差异相关，还需要进一步对多批样品进行考察。另外，试验前期也摸索了人参皂苷Rb1的分布情况，但含量较低，故未列入考察。经过文献查阅，人参皂苷Ro与竹节参皂苷Ⅳa之间的未知峰可能为竹节参皂苷Ⅳ，但因未找到对照品，故本次也未列入考察，可以考虑在下一步试验中进行研究。
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　　（收稿日期：2019-10-08）
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