基于熵权法的响应面优化罗望子果肉活性物质酶法浸提工艺

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　　摘  要：为优化罗望子果肉浸提工艺，提供罗望子果肉加工与罗望子果肉活性物质研究的理论依据。本研究以多糖提取率、原料利用率、总酚提取率和总黄酮提取率为响应值，以熵权法赋权，通过响应面法对罗望子果肉纤维素酶法浸提工艺进行优化，并对其浸提过程中浸提液的抗氧化活性变化进行了研究。结果发现罗望子浸提液对于OH·清除能力极强，均大于190 mg/100 mL，OH·清除能力和ABTS+·清除能力对提取条件的变化敏感。考虑实际情况得到最佳提取工艺的提取时间为51 min，料液比为1∶10.9（g/mL），纤维素酶添加量为质量比1.5‰，在此条件下，罗望子果肉多糖提取率为12.66%，原料利用率为88.24%，总酚提取率为4.79‰，总黄酮提取率为4.38‰，与理论预测值接近。该模型能较好预测罗望子果肉的浸提工艺，可以用于保健饮料加工。
　　关键词：罗望子;响应面;熵权法;抗氧化
　　中图分类号：TS255.44      文献标识码：A
　　Response Surface Optimization of Enzymatic Extraction of Active Substances from Tamarind Pulp Based on Entropy Weight Method
　　LIU Xiaoping， LIU Lu， ZOU Yuke， LU Xuanchi， CHEN Anjun*
　　College of Food Science， Sichuan Agricultural University， Ya’an， Sichuan 625014， China
　　Abstract： The study was aimed to optimize the extraction process of tamarind pulp. The polysaccharide extraction rate， raw material utilization rate， total phenolics extraction rate and flavonoids extraction rate were used as the response value， and the entropy weight method was used to optimize the cellulase extraction process. The antioxidant activity of the extract during the extraction process was studied. The results showed that the tamarind extract had strong OH· scavenging ability， and both were more than 190 mg/100 mL. The OH· scavenging ability and ABTS free radical scavenging ability were sensitive to the changes of extraction conditions. Considering the actual situation， the optimal extraction process was 51 min， the ratio of material to liquid 1∶10.9， and the amount of cellulase 1.5‰. Under this condition， the extraction rate of tamarind pulp polysaccharide was 12.66%， the yield was 88.24%， the total phenolics extraction rate was 4.79‰ and the total flavonoid， extraction rate was 4.38‰， which was close to the theoretical prediction. The model could well predict the extraction process of tamarind pulp， which could be used in health beverage processing.
　　Keywords： Tamarindus; response surface; entropy weight method; antioxidant
　　DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.05.023
　　羅望子（Tamarindus indica L.），又名酸角、酸豆，是一种苏木科（Caesalpiniaceae）酸豆属（Tamarindus）的高大乔木植物[1]。主要分布在全世界热带亚热带地区，我国主产区为云南、四川两省境内的金沙江干热河谷[2]。罗望子的气味芳香，可直接食用，也可加工成果汁、果酱和调味料等产品。罗望子果肉中含有丰富的糖类，其中还原糖含量高达33.33%，这在众多水果中都属少见[3]。罗望子还是一种食药同源的植物，罗望子果肉有抑菌、降血糖、抗突变等功效[4]。Martinello等[5]以70%乙醇对罗望子果肉进行了提取，提取物中糖类、酚类和黄酮类化合物含量较高，具有较强的DPPH·清除能力，且能够显著降低高胆固醇血症的仓鼠血清总胆固醇水平。Tril等[6]同样发现罗望子果肉提取物具有抗革兰氏阳性和抗革兰氏阴性细菌的抗菌活性，且在水提物中总酚含量为3.28 mg/g，黄酮含量为43.34 mg/g，且具有较强的DPPH·清除能力和铁离子还原能力。Sharma等[7]对罗望子果肉多糖进行了提取，发现其DPPH·的半数抑制浓度为0.05 mg/mL，显著低于苹果果胶和商业果胶。然而，目前对罗望子具体的药理作用机制还不明确，但多糖、酚类和黄酮类物质被证明是罗望子果肉中活性较高的物质。 　　目前对罗望子果肉浸提取汁工艺优化相关研究极少，罗望子果肉水分含量低，含有大量果胶、纤维素、半纤维素等物质，难以用压榨法取汁。如果单独采用浸提法原料利用率低，且浸提温度较高、浸提时间较长，容易造成热敏性物质的降解。纤维素酶通过对植物细胞壁的破坏，提高细胞壁的透过性，有助于细胞内溶物溶出，且酶提取法具有提取条件温和和提取效率高等优点。熵权法是一种客观赋权法[8-9]，利用指标的变异性大小确定权重，其优点是不掺杂主观判断，更科学地进行多指标的综合评价。为提高罗望子果肉浸提的效率，并尽可能减少对活性物质结构的影响，本研究采用纤维素酶和热水浸提相结合的方法，对罗望子果肉浸提取汁工艺进行了优化，旨在为今后的罗望子果肉加工利用提供理论依据。
　　1  材料与方法
　　1.1  材料
　　1.1.1  材料与试剂  罗望子由昆明市建航商贸有限公司提供;蒽酮、3，5-二硝基水杨酸、福林酚、没食子酸、芦丁、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼等均为分析纯，购于成都科隆化学品有限公司;纤维素酶（酶活力：1×105 U/g，最适温度50 ℃，最适pH 4.8），购于和氏璧生物科技有限公司。
　　1.1.2  仪器与设备  Thermo BR4i型冷冻离心机，美国赛默飞世尔科技有限公司;Varioskan Flash型荧光酶标仪，美国赛默飞世尔科技有限公司;HZ85-2型磁力搅拌机，北京中兴伟业仪器有限公司。
　　1.2  方法
　　1.2.1  罗望子果肉提取液的制备  将新鲜的甜型罗望子去壳去籽得到罗望子果肉，所得果肉混合均匀后于?20 ℃储藏备用。称取适量的罗望子果肉按比例加入水后打浆1 min，根据底物质量加入纤维素酶，在50 ℃条件下水浴一定时间，6000 r/min离心10 min得到提取液。
　　1.2.2  单因素及响应面实验设计  固定料液比为1∶9、纤维素酶添加量为质量比0.12‰、酶解时间为40 min，控制料液比分别为1∶3、1∶6、1∶9、1∶12、1∶15（g/mL），纤维素酶添加量为质量比0‰、0.6‰、1.2‰、1.8‰、2.4‰，酶解时间为0、20、40、60、80 min进行实验，选取出较优提取条件进行响应面实验。
　　1.2.3  提取液多糖含量及多糖提取率的测定  采用蒽酮-硫酸法[10]测定罗望子果肉提取液中总糖含量。提取液中还原糖含量的测定采用3，5-二硝基水杨酸法[11]测定，用公式（1）计算提取液中多糖提取率。
　　多糖含量=（总糖含量?还原糖含量）/果肉干重×100%                               （1）
　　1.2.4  总酚的测定  采用Folin-Ciocalteus法，取样品0.4 mL，加入2 mL稀释10倍的Folin酚试剂，反应5 min后加入10% NaCO3溶液3 mL，混合均匀后常温放置1 h，于765 nm处测定OD值，对比相应的没食子酸標准曲线计算总酚含量。
　　1.2.5  总黄酮的测定  采用分光光度法，吸取稀释了2倍的样品溶液0.3 mL，加入30%的乙醇3.4 mL和0.5 mol/L的NaNO2 0.5 mL，6 min后加入0.3 mol/L的AlCl3·6H2O 0.15 mL，6 min后在410 nm处测定OD值，并对比相应芦丁标准曲线计算黄酮含量。
　　1.2.6  OH·清除能力测定  取罗望子果肉浸提液按比例稀释至料液比为1∶15（g/mL），再将稀释后的提取液稀释10倍后参考杨江涛等[12]的方法测定，以抗坏血酸当量计算浸提液的OH·清除能力。
　　1.2.7  DPPH·清除能力测定  取罗望子果肉浸提液按比例稀释至料液比为1∶15（g/mL），参考Razali等[13]的方法测定，以抗坏血酸当量计算浸提液的DPPH·清除能力。
　　1.2.8  ABTS+·清除能力测定  取罗望子果肉浸提液按比例稀释至料液比为1∶15（g/mL），参考曾慧婷等[14]的方法测定，以抗坏血酸当量计算浸提液的ABTS+·清除能力。
　　1.2.9  原料利用率  分别精确称取提取前果肉重量和提取后残渣重量，测定含水量，以干物质重量计算罗望子果肉利用率。
　　1.3  数据标准化方法
　　采用离差标准化法对数据进行标准化，消除量纲和变异大小因素的影响，便于不同单位或量级的指标能够进行比较和加权。
　　1.4  权重系数的计算
　　采用熵权法计算指标的权重，各指标的权重值为wj。将标准化后的数据进行公式（2）运算得到第j项指标的信息熵Ej。
　　（2）
　　式中，dij表示为第j个指标下第i个项目的评价值;pij表示第j个指标下第i个项目的指标值的比重;m表示评价对象的数量;n表示评价指标的数量。其中，如果pij=0，则定义。
　　按照公式（3）计算各指标的客观权重值。
　　（3）
　　1.5  数据处理
　　所有数据均重复3次，采用Origin 8.0进行绘图，采用Minitab 17进行相关性分析，采用Design-Ex pert 8.0.6二次回归旋转组合实验设计和数据处理。
　　2  结果与分析 　　2.1  单因素实验结果分析
　　如图1可知，在纤维素酶添加量为1.2‰、提取时间为40 min的条件下，在料液比为1∶3（g/mL）时，多糖提取率、总酚及总黄酮提取率均较低，原料利用率不高。在提高料液比的过程中，三者提取率均显著升高，当料液比达1∶9（g/mL）后，继续增加水的比例对总酚及总黄酮的提取率的提高影响不大，且水的比例继续增加可能造成纤维素酶浓度的降低，进而导致多糖提取率降低，所以选择料液比1∶9（g/mL）作为较优条件进行下一步实验。
　　由图2可知，在提取时间为40 min、料液比为1∶9（g/mL）的条件下，纤维素酶添加量在0‰～1.2‰范围内随加酶量的增加，3种活性物质的提取率显著增加。当纤维素酶添加量到达1.2‰后，继续提高酶浓度3种活性物质提取率没有显著提升，说明酶的添加量增加到一定程度后，继续添加酶已经没有足够的底物与之进行反应，因此三者的提取率不再上升。而在酶添加量较高时，总酚提取率发生下降可能是纤维素酶对果肉细胞的破坏导致一些多酚氧化酶的释放与酚类物质作用。综合考虑生产成本的因素，选择较优纤维素酶添加量为1.2‰进行下一步实验。
　　由图3可知，在纤维素酶添加量为0.12‰的条件下，随提取时间延长，多糖提取率随时间延长提升不显著，而总酚、总黄酮提取率显著上升。由图3可知，当提取时间到达40 min后，继续延长提取时间，多糖提取率不再上升，而多酚、黄酮提取率下降可能是多酚类物质和黄酮类物质稳定性较差而发生氧化。综合考虑能源因素及生产成本，选择提取时间40 min为较优条件进行下一步实验。
　　2.2  提取条件对浸提液体外抗氧化能力的影响
　　由图4可知，浸提液对3种自由基均具有较强的清除能力，尤其对于OH·清除能力均在190 mg/100mL以上。浸提液对不同自由基清除能力大小为OH·>ABTS+·>DPPH·，浸提液对于不同自由基清除能力有着巨大差异可能是由于浸提液中活性物质组成和维生素C对不同自由基清除能力的差异有关。随着料液比、纤维素酶添加量、提取时间的增加，浸提液对于OH·和ABTS+·清除能力显著增加，而提取液对DPPH·清除能力没有显著提升。但是当提取时间达到40 min后，继续延长提取时间会造成浸提液对OH·清除能力的减弱。
　　2.3  相关性分析结果
　　由表1可知，3种活性物质提取率与浸提液对各个自由基清除能力之间均呈正相关。其中，OH·清除能力和ABTS+·清除能力与3种活性物质提取率均呈极显著正相关，相关系数均在0.850以上。而浸提液DPPH·清除能力仅表现出对总酚和黄酮提取率有着极显著正相关，但相关系数均在0.850以下，而浸提液DPPH·清除能力对于多糖提取率相关性不显著，这说明活性物质的溶出有助于提高浸提液的抗氧化活性。
　　2.4  回归旋转组合实验设计及结果
　　通过单因素实验得到的较优条件，利用二次回归旋转组合实验设计进行进一步的优化，实验设计和结果分别见表2和表3。利用Design-Expert软件建立各指标和因素之间的回归模型，去除不显著的乘积项之后，统计结果如表4所示。Y1、Y3、Y4的回归模型拟合度均较高，R2均在0.9以上。所有指标的回归模型均达到极显著水平（P< 0.01），失拟项均不显著（P>0.05）。说明各指标的回归模型均能在一定因素水平范围内反映该指标的变化规律。
　　2.5  综合评分及回归模型及方差分析
　　根据响应面实验结果，利用熵权法对各个响应值赋权值得到权重系数，多糖提取率为0.1855、原料利用率为0.1988、总酚提取率为0.3086、总黄酮提取率为0.3094。得到的综合评分结果如表5，各因素与综合评分回归模型的方差分析结果如表6。模型极显著，失拟项不显著，决定系数为0.9931，说明回归模型依然能很好地与所选变量进行拟合，综合评分法用于罗望子果肉浸提工艺是稳定可靠的。去除不显著的乘积项后得到的回归方程为：
　　2.6  交互作用分析
　　根据响应面的等高线的形状可判断响应值与各因素间的相互作用，等高线的形状可以反映出交互效应的强弱[15]。如图5，酶添加量和料液比交互作用的响应面图坡度最大，可见这2个因素对综合评分的影响最显著。酶添加量与料液比的等高线近似圆形，可知它们之间的相互作用对综合评分的影响较小。而料液比与提取时间、酶添加量与提取时间的等高线呈扁平状，说明这2组因素之间的相互影响较强。
　　2.7  罗望子果肉多糖提取的最优条件的确定和验证
　　利用Design Export软件建立综合评分和各因素间的回归模型，分析数据得到罗望子果肉多糖浸提的最佳工艺条件为提取时间51.25 min，料液比1∶10.86（g/mL），纤维素酶添加量1.52‰。考虑到实际因素，将提取条件设定为提取时间51 min，料液比1∶10.9，纤维素酶添加量1.5%。此条件下的模型预测值为罗望子果肉多糖提取率为12.66%，原料利用率为88.24%，总酚提取率为4.71‰，总黄酮提取率为4.25‰，模型实测值为罗望子果肉多糖提取率为12.49%，原料利用率为87.65%，总酚提取率为4.79‰，总黄酮提取率为4.38‰，提取液各指标实测值与理论值相对误差均小于5%，因此可将该优化模型用于罗望子果肉的浸提工艺，具有一定的准确性和可靠性。
　　3  讨论
　　本研究采用纤维素酶法优化罗望子果肉浸提工艺，在单因素试验基础上，采用回归正交旋转组合实验设计优化提取工艺，并以熵权法对各响应值赋權值。结果表明，在提取过程中浸提液抗氧化活性与活性物质提取率呈正相关，浸提液对OH·清除能力达到194.72～290.87 mg/100 mL，对ABTS自由基及DPPH自由基也有较强的清除能力。这与罗望子果肉浸提液中活性物质组成及化学特性密切相关，研究表明多糖类物质[16]、酚类物质[17]和黄酮类物质[18]对这几种自由基有较强的清除能力。 　　通过各因素对综合评分建立回归模型结果表明，考虑实际情况得到最佳提取工艺的提取时间为51 min，料液比为1∶10.9（g/mL），纤维素酶添加量为1.5%。在此条件下，罗望子果肉多糖提取率为12.66%，原料利用率为88.24%，总酚提取率为4.79‰，总黄酮提取率为4.38‰，与理论预测值接近，说明该模型能较好预测罗望子果肉的浸提工艺。热水浸提法提取罗望子果肉多糖提取率为8.54%[19]，比本研究中罗望子果肉多糖提取率低，进一步说明纤维素酶处理能够提高罗望子果肉的浸提效率。总酚和总黄酮提取率与Tril等[6]的研究相近;但Martinello等[5]以乙醇为溶剂对罗望子果肉进行提取，得到了更高的提取率，这可能与提取溶剂的不同密切相关，根据相似相溶的原理，酚类物质和黄酮类物质在低极性的溶剂中溶解度更大[20]。在罗望子果肉浸提工艺多指标决策的过程中，权重问题的研究有着重要的地位。熵权法作为一种客观权重法，可以很好地避免人为主观选择、偏好等对评价结果的影响。有学者将其与响应面法结合用于中药的提取研究，可最大程度地保留中药中原有的临床有效物质[21-22]。本研究将其应用于罗望子果肉浸提工艺同样取得了很好的拟合效果，得到了品质较好的罗望子果肉浸提液，降低了生产成本。
　　浸提工艺是果蔬汁生产的关键工艺之一，本研究所建立的模型较好地拟合罗望子果肉浸提工艺，可以进一步应用于保健饮料加工。罗望子浸提液表现出良好的抗氧化活性，可作为天然的新型抗氧化剂进一步研究。
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