基于全基因组RNA测序探索糖尿病周围神经病变的发病机制

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　　【摘要】目的 通过对GEO数据库的糖尿病周围神经病变（DPN）、糖尿病（DM）和正常人的血液全基因組RNA 数据集富集分析，探讨DPN的发病机制。方法 对GSE95849芯片的数据进行GSEA分析。结果 与正常组相比，DPN中有12637个基因高表达，9200个基因在DM中高表达，DPN相比起DM有13630（67.6% ）个基因表达上调;有32个基因集参与了DPN的发生，4个基因集涉及DM的发病。结论 NF-kB信号通路、转化生长因子-β信号、未折叠蛋白反应、P53、缺氧因子可能与DPN的发病有关，而β细胞、KRAS蛋白信号可能涉及DM的发生。
　　【关键词】DPN;GEO;GSEA
　　糖尿病（DM）已成为全球第七大死因。DM会导致100多种并发症。临床发现[1]，30%～40%的DM患者至少会发生一种并发症。DM并发症包括心血管病变，神经病变，视网膜病和肾病等。其中，神经病变可累及中枢神经及周围神经，后者尤为常见。研究显示[2]，1型DM患者（T1DM）的神经病变率为66%，2型DM（T2DM）为59%。糖尿病周围神经病变（DPN）已经成为最严重的DM并发症。
　　慢性高血糖是引发DPN的主要因素。实验证明[3]T1DM患者在治疗血糖后DPN发病率降低。也有研究发现[4]血糖控制良好的T2DM依然发展为DPN。说明高血糖是引起DPN的关键因素，但只从宏观角度去控制血糖不足以改善DPN，需要更多地从基因表达的微观途径探讨。研究DPN的功能表达谱有助于开展精准治疗。而全基因组表达组学分析能为DPN的分子机制提供新的见解。
　　本研究利用GEO数据库里的女性DPN、DM和健康者的全基因组表达数据开展GSEA富集分析，分析基因表达差异，探讨DPN的功能通路，为DPN的精准治疗提供一定的分子依据。
　　1 资料与方法
　　1.1 一般资料
　　在GEO数据库中以关键词“Diabetic Neuropathy”搜索发现GSE95849芯片数据为研究对象。该芯片包括18例研究对象（6例女性DPN，6例DM，6例健康者）的血样全基因组的总RNA信息。 。
　　1.2 数据预处理
　　对探针信号值进行归一化处理，若有多个探针对应同个基因的，对信号值求取中位数作为唯一表达值。根据Gene Symbol将探针转换为基因名称。
　　1.3 GESA富集分析
　　利用该18例研究对象的全血总RNA测序信息，按照DPN、DM和正常组，用Hallmark库进行注释，进行GSEA富集分析，置换类型为gene sets，置换检验次数为1000次，探索DPN和DM在表达水平与哪些特定生物学意义的基因集有显著关联。以校正后的归一化的富集得分（NES）绝对值>1，标化显著性水准P<0.05，校正多重假设检验FDR<0.25的富集结果为有统计学意义。
　　2 结 果
　　2.1 差异表达筛选
　　如表1，12637（62.7%）个基因在DPN患者中高表达，7512（37.3%）个基因在正常组中高表达，DPN患者与正常组的信噪比值约为1.85：1（64.9%;35.1%）。
　　9200（45.7%）个基因在DM患者中高表达，10949（54.3%）个基因在正常组中高表达，DM患者与正常组的信噪比分值各为35.9%和64.1%。
　　而与DM患者相比，有13630（67.6%）个基因在DPN中表达更高，6519（32.4%）个基因在DM患者中表达更高，DNP患者和DM患者的信噪比大小分别是77.5%和22.5%。
　　2.2 GSEA功能富集分析
　　与正常组相比，共有32个基因集参与了DPN的发生。9个基因集在FDR<0.25时显著富集，差异有统计学意义（P<0.01），3个基因集达到富集标准。差异有统计学意义（P<0.05），有8个基因集达标。其中，参与程度排前的基因集涉及NF-kB信号通路（图1A）、转化生长因子-β信号通路（图1B）、未折叠蛋白反应、P53通路、缺氧因子、细胞顶端连接和UV诱导反应上调分子功能。
　　DM患者有4个基因集富集。在FDR<0.25和P<0.05时分别有1个基因集显著富集。基因富集显著的分子机制与β细胞、KRAS蛋白信号等功能有关。
　　3 讨 论
　　超过50%的DM患者都可能发展为DPN，DPN患者下肢疼痛麻木甚至感觉丧失，严重影响生活质量。研究DPN的分子机制，有助于靶点治疗。而生物信息学分析，可帮助研究者在大量遗传表达信息中更精准地定位有意义的研究方向。
　　本研究通过GSEA富集分析发现DPN和DM的分子通路都与免疫功能相关。由于神经组织的高度氧化应激敏感，线粒体在高糖环境中产生大量活性氧， 激活NF-kB，诱发炎症反应或细胞凋亡，最后导致神经损伤。刘红梅[5-6]发现，血糖波动的DM大鼠的DPN病情比持续高糖的DM大鼠更严重，NF-kB表达量也是该组大鼠最高，这与氧化应激水平升高会导致神经超微结构病变及传导功能受损一致的观点一致，说明血糖波动可能增加NF-kB。研究发现[7-8]治疗DPN的关键是通过抑制NF-Kb通路。高血糖引起的线粒体功能障碍和ROS的产生也是DPN的可能病因。研究发现[9]缺氧诱导因子1α（HIF1α）信号传导受损会导致DM小鼠早期感觉丧失。说明HIF1α是周围感觉神经元中ROS的上游调节剂，并通过限制ROS水平和诱导VEGF的表达来抑制高血糖引起的神经损伤。但是，这些功能分子与DPN的关系都只是在动物模型上论证，人群患者的推广性受到限制。作为补充，本研究的结果从人群DPN的角度揭示了NF-Kb信号通路在其中参与的可能性。
　　研究[10]提出：内质网应激可能导致DPN，而未折叠的蛋白反应能降低DPN的发生。有研究[11]建议TGF-β1作为DPN的标志物。这与本研究的结果未折叠的蛋白反应和生长因子可能与DPN相关的观点一致。 　　此外，本研究还暗示了P53、细胞頂端连接和UV诱导反应与DPN有关的可能性，这些可能涉及的分子机制不同于DM的分子机制，有助于未来发掘更多的DPN独立于DM的机制成因。
　　综上，本研究利用生信分析，探讨了DPN的成因，从侧面补充了动物实验的论点，为DPN的研究提供一些参考，但这些机制还需要进一步的分子实验进行证明。
　　参考文献
　　[1] Kautzky W，et al.Sex and gender differences in risk，pathophysiology and complications of type 2 diabetes mellitus.Endocr Rev，2016.
　　[2] Cameron E，et al.Vascular factors and metabolic interactions in pathogenesis of diabetic neuropathy.Diabetologia，2001
　　[3] Bommer，C，et al，Global Economic Burden of Diabetes in Adults.Diabetes Care，2018.
　　[4] Duckworth W，et al.Glucose control and vascular complications in veterans with type 2 diabetes.N Engl J Med.2009.
　　[5] 刘红梅，等.血糖波动对糖尿病大鼠周围神经病变影响的研究.中国糖尿病杂志，2019.
　　[6] 程思宇，等.基于NFκb信号通路探究当归四逆汤对糖尿病大鼠周围神经病变保护机制.长春中医药大学学报，2019.
　　[7] 周夏慧，等.当归多糖对DPN大鼠TLR4/MyD88/NFκB通路抑制影响.中国临床药理学与治疗学，2013.
　　[8] 吕翠岩.中药复方糖痹康对糖尿病大鼠坐骨神经TNF-α-NF-κB途径的影响.中华中医药杂志，2016.
　　[9] Rojas R，et al.Hypoxia-inducible factor 1α protects peripheral sensory neurons from DPN by suppressing accumulation of reactive oxygen species.J Mol Med，2018.
　　[10] O'Brien D，et al.ER stress in diabetic peripheral neuropathy：a new therapeutic target. Antioxidants redox signal，2014.
　　[11] Ybarra J，et al.Transforming growth factor beta1 as biomarker of DPN.J Diabetes Complications，2010.
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