丹金胶囊质量标准研究

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　　摘要 [目的]建立丹金胶囊质量标准。[方法]通过薄层色谱法对丹金胶囊中金银花和当归进行定性鉴别，通过高效液相色谱法对丹金胶囊中丹酚酸B、原儿茶醛以及丹参素进行含量测定。[结果]薄层色谱斑点清晰，分离度好，阴性对照无干扰。丹酚酸B、丹参素、原儿茶醛分别在进样量在0.76～22.80、0.68～20.40、0.66～19.80 μg/mL与峰面积积分值线性关系良好（r=0.999 4、0.999 7、0.999 9），平均回收率分别为99%、98%、99%，RSD分别为1.98%、1.70%、1.97%（n=6）。[结论]该方法操作简便、专属性高、重复性好，可作为丹金胶囊的质量控制方法。
　　关键词 丹金胶囊;丹参;金银花;当归;质量标准
　　中图分类号 R 284文献标识码 A文章编号 0517-6611（2020）01-0186-03
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.01.056
　　开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　Study on Quality Standard of Salvia miltiorrhiza Capsule
　　CHEN Biao mei
　　（Department of Pharmacy，First Affiliated Hospital，Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou，Guangdong 510000）
　　Abstract [Objective] The research aimed to establish the quality standard for Salvia miltiorrhiza capsule.[Method]The quality of Lonicera Japonica and Angelica sinensis in Salvia miltiorrhiza capsule was qualitatively identified by thin layer chromatography. The content of salvianolic acid B， protocatechuic aldehyde and salvianic acid in Salvia miltiorrhiza capsule was determined by high performance liquid chromatography.[Result]The TLC spots were clear， the resolution was good， and the negative control had no interference. The salvianolic acid B， salvianic acid and protocatechuic aldehyde showed good relationship in the range of 0.76-22.80， 0.68-20.400， 0.66-19.80 μg/mL（r=0.999 4，0.999 7，0.999 9）. The average recovery rate was 99%，98%，99%， RSD was 1.98%， 1.70%， 1.97%（n=6）， respectively. [Conclusion]The method is simple in operation， high in specificity and good in repeatability， and can be used as a quality control method for Salvia miltiorrhiza capsule.
　　Key words Danjin capsule;Salvia miltiorrhiza;Lonicera japonica;Angelica sinensis;Quality standard
　　丹金胶囊由丹参、金银花以及当归3味中药组成，具有祛瘀活血、清热解毒的功效，尤对于痤疮患者有较好的疗效。方中丹参为君药，具有活血祛瘀、通经止痛、清心消烦、凉血消痈的功效;金银花清热解毒消痈，当归活血行血滋阴，共为臣药[1]。目前该制剂尚未制定质量标准，为了更好地对其进行质量控制，保证疗效的稳定以及用药安全，该研究采用薄层色谱（TLC）鉴别方中的臣药金银花和当归，并采用高效液相色谱法（HPLC）对君药丹参的3种成分（丹酚酸B、丹参素以及原儿茶醛）进行定量测定。
　　1 材料与方法
　　1.1 试药
　　丹金胶囊（批号20181217A、 20181217B、20181217C、20181217D、20181217E、 20181217F、20181217G、20181217H、20181217I、20181217J），缺当归丹金胶囊阴性样品、缺金银花丹金胶囊阴性样品以及缺丹参丹金胶囊阴性样品（批号20181218、20181219、20181220），由實验室自制;当归对照药材、金银花对照药材（批号120546-201804、140325-201805），购于中国药品生物制品检定研究所;对照品丹酚酸B、原儿茶醛、丹参素、绿原酸、阿魏酸（纯度分别为 98.28%、99.63%、99.45%、99.76%、99.60%，批号分别为MUST-18051711、MUST-18123258、 MUST-18110524、MUST-18044420、MUST-18061224），购于成都曼思特生物科技有限公司。 　　1.2 仪器
　　戴安U3000型高效液相色谱仪，检测器为VWD 3400RS（美国Thermo公司）;CAMAG ATS4型全自动点样仪（瑞士卡玛公司）;Biostep VD80薄层色谱成像系统（德国迪赛克公司）。
　　1.3 TLC鉴别
　　1.3.1 金银花TLC鉴别。
　　取10mg绿原酸对照品，加甲醇制成1 mg/mL的对照品溶液。
　　称取丹金胶囊内容物5 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，超声处理20 min，过滤后取续滤液，即为供试品溶液。称取金银花对照药材0.2 g，依法制得对照药材溶液;另取不含金银花的丹金胶囊内容物5 g，同法制备得阴性对照品溶液。
　　分别吸取以上4种溶液各2 μL，在同一硅胶H薄层板上点样，以乙酸丁酯-甲酸-水（7.0∶2.5∶2.5）为展开剂，展开，取出，晾干后置于紫外366 nm下观察。
　　1.3.2 当归TLC鉴别。
　　称取丹金胶囊内容物5 g，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醚20 mL，超声处理20 min，过滤，滤液挥干，残渣加乙醇1 mL使溶解，即为供试品溶液。称取当归对照药材0.5 g，依法制得对照药材溶液。另取不含当归的丹金胶囊内容物5 g，同法制备得阴性对照品溶液。
　　分别吸取以上3种溶液各2 μL，在同一硅胶G薄层板上点样，以正己烷-乙酸乙酯（4∶1）为展开剂，展开，取出，晾干后置于紫外366 nm下观察。
　　1.4 含量測定
　　1.4.1 对照品溶液的制备。精密称取9.49 mg丹酚酸B对照品、8.41 mg原儿茶醛对照品和8.30 mg 丹参素对照品，置于25 mL棕色量瓶中，加80%甲醇稀释至刻度，密塞，摇匀，制得含丹酚酸B、原儿茶醛和丹参素分别为0.38、0.34和 0.33 mg/mL的标准贮备液。精密量取0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、1.50 mL混合对照品贮备液，置于 25 mL棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，密塞，摇匀，用于标准曲线绘制。
　　1.4.2 供试品溶液的制备。取本品胶囊内容物约1 g，精密称定，置25 mL容量瓶中，加入80%甲醇20 mL，密塞，超声处理30 min，放冷，用相应溶剂定容至25 mL，摇匀后过滤，滤液用微孔滤膜（0.22 μm）滤过，即得供试品溶液。
　　1.4.3 阴性对照样品的制备。取不含丹参的本品胶囊内容物约1 g，依“1.4.2”方法制得阴性对照品溶液。
　　1.4.4 色谱条件。Agilent ZORBAX SD C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～30 min，25% A;30～40 min，25%～90%A;40～50 min，90%A;50.0～50.5 min，25%A）;流速1.0 mL/min;检测波长286 nm;柱温25 ℃。
　　1.4.5 方法学考察。
　　1.4.5.1 专属性考察。取“1.4.1”“1.4.2” “1.4.3”制备的溶液按照“1.4.4”色谱条件进样分析，获取阴性样品、对照品、供试品溶液色谱图。
　　1.4.5.2 线性关系的考察。取“1.4.1”中配制的标准曲线溶液按照“1.4.4”色谱条件进样分析，以进样浓度（μg/mL）为横坐标、峰面积积分值为纵坐标绘制标准曲线，计算得各对照品的回归方程和线性范围。
　　1.4.5.3 稳定性试验。取“1.4.2”项下同一份供试品，按“1.4.4”色谱条件于0、2、4、8、12、24 h分别进样，进样量10 μL，测定峰面积积分值，计算RSD。
　　1.4.5.4 精密度试验。取“1.4.2”项下同一份供试品，重复进样6次，计算峰面积的RSD值。
　　1.4.5.5 重复性试验。取同一批次样品，按“1.4.2”方法平行制备6份供试品，按“1.4.4”色谱条件分别进样，测定峰面积，计算平均含量和RSD。
　　1.4.5.6 加样回收试验。取已知含量的样品6份，按照1∶1的比例添加3种对照品，按“1.4.2”方法制备供试品，按“1.4.4”色谱条件分别进样，测定峰面积，计算平均回收率和RSD。
　　1.4.6 样品的含量测定。为进一步考察方法的稳定性，精密称取10批胶囊样品内容物，按“1.4.2”方法制备样品溶液，进样测定，记录峰面积，计算含量。
　　2 结果与分析
　　2.1 TLC鉴别
　　丹金胶囊的TLC鉴别结果如图1～2所示。由图1可知，供试品色谱与金银花对照药材及绿原酸对照品在色谱相应位置上呈现相同颜色斑点，阴性样品无相应特征斑点。由图2可知，供试品色谱与当归对照药材在色谱相应位置上呈现相同颜色斑点，阴性样品无相应特征斑点。说明该鉴别方法准确、可靠。
　　2.2 方法学考察
　　2.2.1
　　专属性考察。由图3可知，在“1.4.4”色谱条件下，3种目标化合物峰形对称，分离度大于1.5，阴性无干扰，说明方法专属性强。
　　2.2.2 线性关系的考察。按“1.4.5.2”方法操作，结果发现（表1），3种成分标准曲线r均大于0.999，有良好的线性关系。
　　2.2.3 稳定性试验。按“1.4.5.3”方法操作，得丹酚酸B、原儿茶醛、丹参素峰面积RSD值均小于2%，表明样品在24 h内稳定性良好。
　　2.2.4 精密度试验。按“1.4.5.4”方法操作，得丹酚酸B、原儿茶醛、丹参素峰面积RSD值分别为0.22%、0.58%、1.45%，表明仪器精密度良好。 　　2.2.5 重复性试验。按“1.4.5.5”方法操作，得6份样品中丹酚酸B、原儿茶醛、丹参素的含量RSD值分别为1.34%、1.28%、1.45%，表明该方法重复性良好。
　　2.2.6 加样回收试验。由表2可见，3种成分的加样回收率为95%～102%，RSD值均小于2%，表明该方法准确度良好。
　　2.3 含量测定
　　从表3可看出，10批次样品丹酚酸B含量为0.45%～0.64%，丹参素含量为0.011%～0.014%，原儿茶醛含量为0.051%～0.058%。
　　3 结论与讨论
　　在2015版《中国药典》[1]中，金银花鉴别项供试品的制备方法是取金银花花粉末浸泡12 h，虽然操作简便，但是耗时长，因此该研究在实际试验中采用超声20 min的方法，结果所得图谱斑点清晰，大大减少了操作时间;对当归的鉴别过程，《中国药典》规定用阿魏酸作为对照品，而在实际操作过程中发现以阿魏酸为对照品时，阴性样品会有干扰，查阅文献发现君药丹参中也含有阿魏酸[2-4]，因此該试验最后采用当归对照药材作为对照，结果所得图谱表明，供试品色谱与当归对照药材在色谱相应位置上呈现相同颜色斑点，阴性样品无相应特征斑点。
　　丹金胶囊君药为丹参，研究表明，丹参活性成分包括脂溶性的丹参酮类和水溶性的丹酚酸类[5-8]，而丹金胶囊中丹参制备工艺为水提，主要含丹酚酸类的成分。丹酚酸类化合物以抗氧化、抗凝血和细胞保护作用特别突出，其中作用较强且研究较多的主要是丹酚酸B、原儿茶醛以及丹参素等[9-10]。因此，该研究采用高效液相色谱法测定这3种成分的含量。对提取溶剂和提取时间的考察结果表明，80%甲醇超声提取30 min，有效成分可完全提取;并且试验中采用梯度洗脱程序，在保证使样品得到较好分离度的同时，又能够
　　缩短样品保留时间，提高检测效率。通过方法学验证也表明，该检测方法简单、重复性好，能够作为丹金胶囊质量控制的内部标准。
　　总体而言，丹金胶囊具有较好的临床疗效。该试验建立了丹金胶囊的质量标准，采用薄层色谱法鉴定其中的金银花与当归，采用高效液相色谱法鉴定其中的丹参，所建立方法 简便、可靠、重复性好，可用于丹金胶囊内在质量的控制，保证临床疗效以及安全。
　　参考文献
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