湖北地方鸡种鸡场弱毒疫苗ＡＬＶ的分离与鉴定

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　　摘要：为探明湖北省地方鸡种鸡场禽白血病净化后出现反弹的原因，通过病毒分离、PCR扩增、基因测序及分子生物学分析，有针对性地检测了种鸡场活疫苗ALV污染情况。结果表明，从活疫苗中分离出一株ALV是外源性ALV-J亚群病毒。
　　关键词：禽白血病;活疫苗;污染;分离;鉴定
　　中图分类号：S831.7         文献标识码：A
　　文章编号：0439-8114（2019）24-0167-03
　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.24.040           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　Isolation and identification of attenuated vaccine ALV
　　from Hubei local chicken breeding farm
　　WANG Hong-cai，WANG Zui，LUO Ling，WANG Hong-lin，LU Qin，ZHANG Rong-rong，
　　ZHNAG Teng-fei，WEN Guo-yuan，LUO Qing-ping
　　（Institute of Animal Husbandry and Veterinary Sciences，Hubei Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Prevention and Control Agents for Animal Bacteriosis/Hubei Key Laboratory of Animal Embryo and Molecular Breeding，Wuhan 430064，China）
　　Abstract： In order to find out the cause of rebound of avian leukosis after purification in local chicken farms， the contamination of live vaccine ALV in chicken farms was detected. Virus isolation， PCR amplification， gene sequencing and molecular biological analysis showed that an ALV strain isolated from live vaccine was an exogenous ALV-J subgroup virus.
　　Key words： Avian leukemia; live vaccine; contamination; isolation; identification
　　禽白血病（Avian leukosis）是由禽白血病病毒（Avian leukosis virus，ALV）引起的禽類多种肿瘤性疾病的总称，该病毒属于逆转录病毒科（Retroviridae）α逆转录病毒属（Alpharetrovirus）[1]。ALV既能通过种蛋垂直传播，也能通过个体之间直接接触发生水平传播。而接种污染了ALV的活疫苗是容易忽视的传播途径，国内外学者曾多次报道从禽用活疫苗中检测出ALV。Zavala等[2]、Silva等[3]、Fadly等[4]、Barbosa等[5]从马立克疫苗中检测出ALV，Fadly等[6]从鸡痘疫苗中检出ALV。毕玉彧等[7]应用PCR方法在3个种鸡场18份活疫苗样品中检测出ALV污染。
　　目前，控制禽白血病的主要措施仍是实施净化和加强种鸡场生物安全。湖北省部分种鸡场在实施净化后，ALV p27阳性率降低至5%以下，第二年又升高至10%左右。为了调查原因，对部分种鸡场的活疫苗进行了ALV分离与鉴定，将结果报告如下。
　　1  材料与方法
　　1.1  材料
　　1.1.1  试剂  疫苗主要从种鸡场临床使用的疫苗中随机抽取;禽白血病ELISA抗原诊断试剂盒，购自IDEXX公司;RNA提取试剂为AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒;PCR试剂购自宝生物工程（大连）有限公司;禽白血病检测引物和测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。新城疫、法氏囊、传染性支气管炎等阳性血清由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所禽病团队保存。
　　1.1.2  仪器  Multiscan MK3酶标仪，Bio-Rad IQ5荧光定量PCR仪，Applied Biosystems Simpliamp PCR仪。
　　1.2  方法
　　1.2.1  ELISA方法检测  将疫苗样品用PBS稀释后，加入相应的抗血清中和60 min后，10 000 r/min离心取上清液经0.22 μm的滤器过滤除菌，然后接种DF-1传代细胞，37 ℃感作1 h，加入细胞维持液37 ℃培养5～7 d。连续培养2代后，将细胞反复冻融3次，吸取细胞上清液，用IDEXX ELISA抗原检测试剂盒进行检测，按照试剂盒说明书的要求进行操作，S/P>0.2判定为阳性。
　　1.2.2  阳性样品gp85基因的RT-PCR扩增  采用RT-PCR方法进行扩增完整的gp85基因[8]，产物大小约为950 bp，上下游引物分别为：gp85-F：5′-GGT
　　GGGGGGAGTTCATCT-3′;gp85-R：5′-GCGAGAGA 　　CGACTCAGCG-3′。已知ALV-J毒株感染细胞DNA作为阳性对照，未感染DF-1细胞基因组DNA作为阴性对照。PCR扩增产物经电泳鉴定后，按文献[9]的方法对PCR扩增产物进行回收、连接、转化，然后将PCR鉴定阳性菌送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。
　　1.2.3  序列拼接和结果分析  将测序文件用DNASTAR软件中SeqMan软件包进行序列装配和拼接，将拼接后的序列与GenBank中已发表的亚群序列进行比对，判定亚型种类。A亚群M37980（RSA株）、DQ365814（MQNCSU株）;B亚群AF052428（Schmidt-Ruppin B株）;C亚群J02342（Prague C株）;D亚群D10652（Schmidt-Ruppin D株）;E亚群M12172（RAV-0株、EF467236（SD0501株）、AY013303（ev-1株）;J亚群Z46390（HPRS-103株）、AF247391（HC1株）、DQ115805（NX0101株）、AY897219（HN0001株）、EU264064（SD07LK1株）;K亚群HM582658（TW-3593株）[10]等。
　　2  结果与分析
　　2.1  活疫苗样品直接ELISA检测结果
　　活疫苗样品经DF-1细胞培养后，取细胞上清液使用ELISA抗原检测试剂盒进行检测，结果表明，有1个样品孔呈阳性。
　　2.2  活疫苗样品RT-PCR检测结果
　　ELISA阳性样品经RT-PCR扩增后，目的条带大小为924 bp（图1），与预期结果一致。
　　2.3  序列拼接
　　样品经正反向测序后，获得两个序列峰图原始数据，使用DNASTAR软件中SeqMan程序进行组装拼接。先除去两端杂峰，然后进行组装拼接，手工校正错误碱基，最后导出一致性序列，即为分离病毒的gp85基因核苷酸序列，长度为924 bp。与HPRS103原型株相比，核苷酸有18个位点发生突变（图2）。
　　2.4  序列的基因分群
　　从NCBI下载ALV亚群代表株序列，提取gp85基因序列，通过DNAStar软件Megalign程序进行多重比对并绘制进化树（图3）。從进化树可以看出，新分离的ALV毒株与J亚群的HPRS103处于同一分支，属于外源性ALV-J亚群病毒。
　　3  讨论
　　中国很多种鸡场均在开展禽白血病的净化工作，且取得较好的成绩，部分种鸡场已达到国家净化标准。如果不慎使用ALV污染的活疫苗，将会出现ALV反弹，严重影响禽白血病的净化进展。程合刚等[11]对山东某鸡场送检的国内及国外疫苗公司生产的7个不同批次的CVI988/Rispens疫苗，发现存在E亚群污染。由于种鸡场使用活疫苗品种多、次数多，因此增加了造成ALV的传播风险。胡晓苗等[12]采用ELISA方法和PCR方法对国内外禽用活疫苗随机抽样进行了检测，结果显示鸡传染性法氏囊B87株、鸡痘、鸡传染性喉气管炎和新城疫等疫苗呈阳性。栾怀彪等[13]对检测弱毒疫苗中低剂量禽白血病病毒（ALV）污染的核酸斑点杂交法和ELISA进行了比较。在利用经典的SPF鸡检查法检测弱毒疫苗中ALV污染时，结合对病原核酸的检测有助于节省检测时间和降低漏检率。因此，加强种鸡场禽用活疫苗的ALV污染检测，对禽白血病净化状态的维持起到重要作用。
　　参考文献：
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　　[2] ZAVALA G，CHENG S. Detection and characterization of avian leukosis virus in Marek's disease vaccines[J].Avian Dis，2006， 50（2）：209-215.
　　[3] SILVA R F，FADLY A M，TAYLOR S P. Development of a polymerase chain reaction to differentiate avian leukosis virus（ALV） subgroups：Detection of an ALV contaminant in commercial Marek's disease vaccines[J].Avian Dis，2007，51（3）：663-667.
　　[4] FADLY A，SILVA R，HUNT H，et al. Isolation and characterization of an adventitious avian leukosis virus isolated from commercial Marek's disease vaccines[J].Avian Dis，2006，50（3）：380-385.
　　[5] BARBOSA T，ZAVALA G，CHENG S. Molecular characterization of three recombinant isolates of avian leukosis virus  obtained from contaminated Marek's disease vaccines[J].Avian Dis，2008， 52（2）：245-252.
　　[6] FADLY A M，WITTER R L，SMITH E J，et al. An outbreak of lymphomas in commercial broiler breeder chickens vaccinated with a fowlpox vaccine contaminated with reticuloendotheliosis virus[J].Avian Pathol，1996，25（1）：35-47.
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