叶酸介导VEGF对糖尿病肾病大鼠足微循环影响研究

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　　【摘要】目的：叶酸介导VEGF对糖尿病肾病大鼠足微循环影响研究。方法：将25只健康雄性sd大鼠适应性喂养1周后随机分为2组，分别为正常组（ 5只）和造模组（ 20只）。给模型组大鼠每天喂高脂高糖日粮，正常组喂基础日粮。4周之后称量体重，给予造模大鼠空腹腹腔注射1%的链脲佐菌素溶液（STZ，30mg / kg），正常组注射相等容量的柠檬酸盐缓冲液。在喂养2周过后，测定正常组与模型组的血糖和胰岛素水平。用基础饲料继续喂养造模后的大鼠和正常组大鼠。模型大鼠随机分为stz组、和低剂量（1.5mg/kg）、中剂量（3.5mg/kg）、高剂量（5.5mg/kg）叶酸组进行干预，再检测大鼠鼠尾血糖浓度。各组均在干预灌胃3d后在心脏处取血制备血清。将完全培养基底加入到面积 75 cm2的培养瓶中行小鼠足细胞培养。将正常组和模型组小鼠足细胞的培养依次分为空白对照组、stz组、正常鼠血清对照组和添加低、中、高剂量叶酸血清组共六组。刺激24 h之后用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测大鼠血清VEGF水平，PCR技术检测mRNA中VEGF水平，后用蛋白质印迹法（W B）检测蛋白质VEGF表达水平。结果：VEGF的阳性表达可以在高糖组和正常鼠血清组小鼠足细胞观察到。添加叶酸的血清组足细胞VEGF在蛋白质和mRNA中的表达比高糖组和正常鼠血清组中的表达明显降低，差异具有统计学意义。结论：叶酸能够介导血管内皮因子（VEGF）水平从而改善糖尿病肾病大鼠足的微循环。
　　【关键词】叶酸 糖尿病肾病 足细胞 血管生长内皮因子
　　一、材料
　　（一）动物
　　健康雄性SD大鼠25只，體重200～220g。
　　（二）药物
　　 叶酸片购于天津力生叶酸片。分别配置低（1.5mg/kg）、中（3.5mg/kg）、高剂量（5.5mg/kg）叶酸。
　　二、实验方法
　　（一）分组与细胞培养
　　将25只健康雄性SD大鼠在基础喂养1周后随机分为2组，分别是正常组（5只）和造模组（20只）。模型组大鼠喂每日喂养高脂高糖饲料。正常组喂以基础饲料。4周后，称重。造模大鼠空腹腹腔注射1%的链脲佐菌素溶液（STZ，30mg/kg），正常组注射相同体积柠檬酸盐缓冲液。在喂养2周后测量血糖和胰岛素水平，模型组大鼠和正常组大鼠继续喂食基础饲料。随后将成模大鼠随机分为正常对照组、1%链脲佐菌素溶液组（30mg/kg）和低（1.5mg/kg）、中（3.5mg/kg）、高剂量（5.5mg/kg）叶酸并注射1%链脲佐菌素溶液组（30mg/kg）组进行干预，干预后检测鼠尾血糖浓度。在灌胃3天后心脏取血制备血清。小鼠足细胞培养：将完全培养基加入到底面积为75cm2的培养瓶中进行培养。
　　（二）指标检测
　　（1）酶联免疫吸附试验（ELISA）  运用双抗体夹心ELISA法检测血管内皮因子VEGF在大鼠血清中的浓度。通过计算确定实验所需的板条数量，并将其取出后再放置于框架中。设置空白孔并仅添加TMB显色液和终止液在空白孔中。对每次实验进行标准测试，并绘制出标准曲线。将不同浓度标准品加入到相应孔中，并在室温下温育120分钟。将板洗涤5次并加入生物素化的抗体工作溶液。在室温下孵育60分钟。将板洗涤5次，加入酶结合物工作溶液，在室温下进行避光孵育20分钟。将板洗涤5次，再加入显色剂TMB100ul/孔，黑暗中温室孵育20分钟，加入50ul/孔的终止液，混合均匀后立刻测量OD450的值。
　　（2）荧光实时定量PCR技术 用于检测mRNA中VEGF水平。首先提取细胞中总RNA并在培养瓶中加入1mlTrizol，在15分钟后将细胞收集到Ep管中，将每只管中加入200μL的三氯甲烷混匀后4℃12000rpm/min中离心20分钟。将取得的上层水相移到新的EP管后，将等量的异丙醇混匀后加入其中再冰上静置15分钟。于4℃12000rpm/min离心20分钟后，弃去上清液并干燥。用75%的无水乙醇lml充分冲洗RNA沉淀后再次进行离心，弃去上清液后于室温干燥。用适量1%的DEPC水来溶解RNA，后用枪轻轻吹打将其混匀，品质鉴定RNA样品。混匀PCR混合物并将其室温孵育1h。95℃预变性10分钟，95℃变秒10秒，60℃退火20秒， 72℃延伸15秒，进行40个循环后记录CT值。将GAPDH作为内参，采用2—△△ct方法分析，对照组为1，计算其余各组相对表达量的情况。
　　（3）免疫印迹法 蛋白质印迹法（Western Blot）分析蛋白质中VEGF的表达水平
　　（三）统计学方法
　　 使用 SPSS 17.0软件进行数据分析。测量数据中计量资料表示为均数±标准差，统计方法使用单因素方差分析和 LSD 检验。
　　三、结果
　　（一）酶联免疫吸附试验（ELISA）测大鼠血清VEGF水平
　　 显微镜下结果显示VEGF在大鼠足细胞的胞浆内表达。正常组和高糖组的细胞浆与核周均可见阳性表达且表达量接近。然而，添加了低、中、高剂量的叶酸组中VEGF的表达较低。
　　（二）荧光实时定量PCR检测mRNA中VEGF水平
　　添加叶酸组中VEGF在mRNA中的表达水平较高糖组和正常鼠血清组明显降低，（p<0.05）并且叶酸剂量与VEGF表达水平呈负相关。叶酸的剂量越高，VEGF在mRNA中的表达水平就越低。
　　（三）蛋白质印迹法（Western Blot）检测蛋白质VEGF表达水平
　　由结果可知与正常大鼠血清组VEGF的表达情况明显升高。添加不同剂量叶酸之后各组大鼠VEGFmRNA表达量均降低。差异具有统计学意义。（P<0.05）。
　　四、讨论
　　 VEGF（血管内皮生长因子）是与血管内皮细胞胞膜上的特定受体结合来引发下游信号级联并促进血管新生的促血管生成因子。大量研究表明，它对血管内皮细胞在骨、肺、肾脏、脑、肿瘤等全身各组织器官的增殖、迁移和趋化具有显著的促进作用。Magdalena Tuszyńska详细阐述了叶酸在人体中的发生和营养作用。叶酸是一种水溶性维生素，在基因调控所需的甲基化过程中起着甲基供体的重要作用。叶酸也参与核糖核酸和脱氧核糖核酸的合成。Sonny Bherwani等人通过测量糖尿病肾病患者血清叶酸与尿微量白蛋白比值发现叶酸水平的下降与糖尿病肾病有关。
　　本实验结果显示，糖尿病肾病小鼠的足细胞VEGF表达较对照小鼠高，显示其在DN 微血管病变中的意义重大。我们在饲料中添加不同剂量的叶酸，结果显示添加叶酸的血清组小鼠足细胞VEGF在蛋白质和mRNA中的表达均较高糖组和正常鼠血清组降低且叶酸剂量与VEGF的表达呈现负相关。由此说明补充叶酸能够介导血管内皮因子（VEGF）水平从而改善糖尿病肾病大鼠足的微循环。
　　基金项目：项目编号：长医教[2018]77号-210。
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