补阳还五汤辅助鼠源MSCs移植治疗SD大鼠脊髓损伤的研究

来源:用户上传      作者:王璐瑶 朱佳文 张文远 王天枢

　　摘 要 目的： 探讨大鼠脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）后神经干细胞（neural stem cells， MSCs）移植与补阳还五汤（Buyang Huanwu decoction， BYHWD）对大鼠脊髓全横断损伤的修复。方法：对脊髓损伤的大鼠分别进行鼠源MSCs移植或补阳还五汤治疗及两者联合治疗，观察治疗后大鼠行为学变化；检测各组细胞wnt3a与β-actin比值。结果：t检验分析表明，MSCs+BYHWD组大鼠的BBB评分值高于脊髓损伤组[（17.77±0.97） vs （15.33±1.02），P<0.05]；Western-Blot结果表明，与对照组相比，MSCs组、BYHWD组及MSCs+BYHWD组的wnt3a表达上调，且MSCs+BYHWD组远高于MSCs组和BYHWD组。结论：补阳还五汤辅助MSCs移植治疗SD大鼠脊髓损伤有一定改善效果，且改善效果远高于MSCs或BYHWD单药治疗。
　　关键词 MSC 脊髓损伤 SD大鼠 补阳还五汤
　　中图分类号：R289.5； Q813.3 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2020）23-0039-04
　　Study on the treatment of spinal cord injury in SD rats by Buyang Huanwu decoction-assisted rat-derived MSCs transplantation*
　　WANG Luyao**， ZHU Jiawen， ZHANG Wenyuan， WANG Tianshu***
　　（Department of Brain Surgery， the First Hospital affiliated to Jiamusi University， Heilongjiang Jiamusi 154002， China）
　　ABSTRACT Objective： To investigate the effect of neural stem cell （MSCs） transplantation and Buyang Huanwu decoction （BYHWD） on spinal cord injury （SCI） in rats. Methods： The rats with spinal cord injury were treated with rat-derived MSCs transplantation or Buyang Huanwu decoction and the combination of the two therapies. The behavioral changes of the rats were observed and the ratios of wnt3a to β-actin in each group of cells were detected. Results： The student’s t tests showed that the BBB score of the rats was higher in the MSCs + BYHWD group than the SCI group [（17.77±0.97） vs （15.33±1.02）， P<0.05]. Western-Blotting results showed that the expression of wnt3a in the MSCs group， BYHWD group and MSCs + BYHWD group was up-regulated as compared with the control group and furthermore its expression was much higher in the MSCs + BYHWD group than the MSCs group and BYHWD group. Conclusion： Buyang Huanwu decoction-assisted MSCs transplantation for the treatment of SCI in rats has certain improvement effect and its effect is much higher compared with MSCs and BYHWD monotherapy.
　　KEy WORDS MSC； spinal cord injury； SD rat； BYHWD
　　脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）由机体中枢神经系统损伤所致，其临床症状主要表现在损伤处平面以下感觉、运动功能的完全或部分丧失，及大小便失禁等，常见脊柱脫位、骨折所致[1]。脊髓一旦发生损伤后，其损失往往呈不可逆性，患者受伤后自理能力下降或基本丧失，造成繁重的家庭和社会负担。因此，寻找到可使脊髓神经元再生、脊髓功能恢复的方法是神经科学领域目前最大的研究热点之一。
　　近年来，再生医学的迅猛发展，利用细胞移植修复来增加脊髓神经细胞，并使得胶质癖痕和空洞减少看到了曙光[2-3]。间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有多项分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控的特点[4]，是良好的细胞移植来源。另外中医理论，“久卧伤气”，脊髓损伤患者多见有气虚血疲之证候，故应以行气血、通经络为治疗方法。阳还五汤具有补气活血、通经活络的功效，临床中常用于中风后遗症、小儿麻痹后遗症以及截瘫或上、下肢痪软属气虚血癖者[5]。将中医补阳还五汤与细胞移植治疗相联合，用于脊髓损伤治疗，目前还未有相关文献报道。 　　本实验从大鼠脊髓处获取原代MSCs进行培养用于治疗大鼠脊髓损伤模型，并联合补阳还五汤灌胃治疗，对脊髓损伤的大鼠治疗前后的行为学、分子水平检测wnt3a及b-catenin蛋白表达情况进行观察，以此分析探究补阳还五汤辅助鼠源MSCs移植治疗SD大鼠脊髓损的治疗情况，以期为脊髓损伤的中西医结合治疗提供新的实验依据。
　　1 材料和方法
　　1.1 试剂与仪器
　　4%水合氯醛（化学纯，中国医药集团上海化学试剂有限公司）；DMSO、10 mmol/L PBS缓冲液（美国HyClone公司）；DMEM、F12、胎牛血清、EDTA、B27和胰蛋白酶（美国Gibco公司）；10 mg/ml 链霉素、100 U/ml 青霉素、a-MEM、2 mmol/L L-谷氨酰胺（美国Life Technologies公司）；胶原酶（瑞士Roche公司）；兔抗鼠wnt3a、b-actin一抗、山羊抗兔荧光二抗，CD（美国Sigma公司）；干细胞生长因子（以色列BI公司），CD45、CD105、CD73、CD90细胞流式检测抗体（美国Biolegend公司）。
　　ST40离心机（美国Thermo Fisher公司）；CytoFLEX流式细胞仪（美国贝克曼库尔特公司）； CO2培养箱（美国Thermo Fisher公司）；Power Pac 1645050基础电泳仪、mini Protren Tetra 1658001蛋白垂直电泳槽（德国伯乐公司）。
　　1.2 方法
　　1.2.1 实验分组
　　选取雌性健康成年SD大鼠60只，体重220～250 g，将其随机分为①正常对照组（Ctrl）；②脊髓损伤组（SCI）；③补阳还五汤灌胃组（BYHWD）；④MSCs移植治疗组（MSCs）；⑤MSCs移植联合补阳还五汤灌胃组（BYHWD+MSCs）；每组各12只。
　　1.2.2 原代MSCs的分离与培养
　　取SD大鼠，用4%水合氯醛麻醉，用75%体积分数医用酒精浸泡大鼠10 min。无菌条件下取出大鼠股骨及胫骨，用PBS清洗3次。剪掉股骨和胫骨的骨骺端，露出骨髓腔，用加入双抗的L-DMEM培养基冲出骨髓，反复进行吹打；将冲出的骨髓制成单细胞悬液，1 000 r/min 离心5 min，弃上清，DMEM重悬以1×109/L的细胞浓度接种于25 cm2细胞培养瓶中进行培养。原代细胞接种48 h后更换全新完全培养基，在3～4 d时半量换液，7～9 d时即可传代。待细胞铺满培养瓶底，密度长至70%～80%融合时，胰酶消化，传代培养（37 ℃，CO2饱和湿度培养环境）。
　　1.2.3 大鼠脊髓损伤后的行为学测试
　　脊髓损伤模型建立：用1 ml/100 g 水合氯醛溶液腹腔注射麻醉大鼠并将其固定。固定后找到大鼠腰2～3棘突，纵切一切口，暴露出皮下组织，用钝性分器将棘突两侧肌肉及腰2～3棘突间韧带剥离开来，暴露出脊髓，找到脊髓后再用22 G 腰麻针垂直扎入，注入0.5%布比卡因4 ml。
　　按照实验分组进行大鼠行为测试，使用BBB评分法评分，观察时间为5 min。注射效果及完整性以大鼠尾动的情况来判断。
　　1.2.4 Western-Blotting检测wnt 3a蛋白表达情况
　　脊椎脱臼法处死每组实验大鼠，用手术剪剪掉股骨和胫骨的骨骺端，露出骨髓腔，PBS缓冲液洗清组织处血液，取大鼠脊髓组织，用剪刀剪碎收集组织置离心管中。1 000 r/min离心5 min，PBS清洗2次。按Solarbio公司总蛋白萃取试剂盒（total protein extraction kit）说明书进行蛋白提取，BCA（bicinchonininc acid）法测定蛋白浓度。按实验分组进行加样后，进行SDS-PAGE蛋白电泳，结束后湿法转膜，做好PVDF膜的标记。转膜完成后，封闭1 h，一抗（1∶1 000稀释）4 ℃过夜孵育。第二天，室温平衡1 h，TBST清洗膜3次，每次5 min。二抗（1∶10 000稀释）室温孵育2 h，TBST清洗二抗，5 min/次，共3次。最后使用化学发光法检测wnt3a蛋白成像。
　　1.3 统计处理
　　2 结果
　　2.1 人羊膜间充质干细胞hAMSCs的形态和免疫表型
　　大鼠骨髓分离培养得到的MSCs，在显微镜放大10倍的光镜下观察，可见MSCs细胞形状成梭形，状态良好（图1）。
　　对分离培养得到细胞进行特异性抗体染色，染色后用流式细胞仪进行检测鉴定，结果显示98%以上的细胞都为一致的阳性表达或阴性表达（图2）。培养细胞不表达白细胞共同抗原CD45，表達CD105、CD90、CD73间充质干细胞表面特性分子标记。证明从小鼠脊髓处分离提取培养的细胞为MSCs，纯度较高。
　　2.2 脊髓损伤后大鼠后肢BBB运动功能评分结果
　　按照实验分组对每组的大鼠后肢进行BBB运动功能评分，观察各治疗组和治疗对照组的BBB评分及运动功能改善情况。大鼠脊髓损伤后给与MSCs、BYHWD、BYHWD+MSCs治疗后其BBB评分值都高于未治疗的SCI组，但单MSCs与BYHWD治疗其BBB评分值与SCI组相比不具有统计学意义；而采取BYHWD辅助MSCs移植治疗后大鼠脊髓受伤后的后肢BBB评分与SCI相比较具有统计学意义（P=0.032 8），结果表示两者联合治疗后对大鼠的运动功能有改善（表1）。 　　2.3 Western-Blotting检测wnt3a蛋白表达结果
　　提取每组蛋白进行检测后发现，MSCs组，MSCs+BYHWD组，BYHWD组的wnt3a蛋白的表达与对照组（Ctrl）和SCI组相比较有明显上调，且MSCs+BYHWD组wnt3a组蛋白的上调远高于MSCs、BYHWD组（图3）。用MSC与BYHWD联合治疗脊髓损伤大鼠，wnt3a蛋白上调最为明显，表明其治疗效果最佳。
　　3 讨论
　　Gao和Chen等[6-7]在胆碱能神经元缺陷的大鼠模型上研究了神经干细胞移植修复脊髓损伤的潜能，结果显示，由神经干细胞分化的胆碱能神经元的轴突能穿越腹侧神经根和坐骨神经，并与外周肌肉组织形成功能性神经—肌肉接头。MSCs具有分化成神经干细胞的潜能，MSCs移植治疗大鼠脊髓损伤，其机制主要通过修复损伤轴突周围的髓鞘，促进轴突再生，并协助新血管的形成，帮助大鼠恢复一定功能[8-9]，细胞移植修复脊髓损伤有切实意义。
　　另外，出自我国清代名医王清任的《医林改错》的补阳还五汤，现代研究表明其药理作用极其广泛，具有抗氧化、抗自由基损伤、改善血液流变学、改善微循环和调节免疫等作用[10-11]。雖然补阳还五汤治疗脊髓损伤的机制尚不十分清楚，但有研究显示，补阳还五汤可以改善损伤脊髓微循环，减少氧化损伤，抑制兴奋性氨基酸的释放，抑制细胞调亡，促进神经递质和神经营养因子的合成，从而促进神经功能的恢复，可改善脑缺血大鼠长期感觉运动功能，减轻脑损伤[10， 12]。然而，现发表的文献缺乏MSCs与中医补阳还五汤联合作用的相关实验探究，对两者治疗方法结合后的治疗效果未知，是一个新兴的研究领域，研究意义深远。
　　本实验通过建立大鼠脊髓损伤模型，对脊髓损伤大鼠进行MSCs体内注射联合灌胃补阳还五汤治疗，与对照组结果相比较，实验结果显示联合治疗后BBB评分值、wnt3a蛋白的表达均高于MSCs体内注射或补阳还五汤单方案治疗。wnt3a的高表达可增加脊髓中有丝分裂的数目[13]。该实验从脊髓受损伤大鼠的行为学表现，wnt信号调控的分子水平上面综合分析了两者联用的治疗效果，大鼠损伤后联用治疗效果较优，促进大鼠恢复。但该模型实验设计较简单，所研究的层面较为粗浅，不能较为充分全面的解释两者联合治疗方式治疗原理，该实验模型结果仅仅为后续更深一步的探究补阳还五汤辅助鼠MSCs移植治疗SD大鼠脊髓损伤技术提供了初浅的实验数据，有待于更多基础实验与临床实验数据用于证明该治疗方式。
　　参考文献
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　　*基金项目：黑龙江省卫生计生委科研课题（201810222058）
　　**作者简介：王璐瑶，主治医师。从事大鼠脊髓损伤模型研究。E-mail： 1766514920@qq.com
　　***通信作者：王天枢，主治医师。从事脊柱外科研究
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