荧光定量PCR法用于诊断肺结核患者痰液中结核分枝杆菌DNA的临床价值

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　　[摘要]目的 探讨荧光定量PCR法用于诊断肺结核患者痰液中结核分枝杆菌（TB）DNA的临床价值。方法 选取2017年7～11月我院收治的25例肺結核或陈旧性结核的患者，并选择同期的25例非结核病呼吸道感染患者。采用荧光定量PCR法、抗酸染色法及培养法检测受检人员痰液的TB，并对检测阳性率及患者满意度进行观察及评估。结果 荧光定量PCR法检测肺结核或陈旧性结核患者的阳性率高于抗酸染色法与培养法，差异有统计学意义（P<0.05）；荧光定量PCR法的敏感性高于抗酸染色法与培养法，差异有统计学意义（P<0.05）；荧光定量PCR法、抗酸染色法及培养法三种方法的特异性比较，差异无统计学意义（P>0.05）；荧光定量PCR法的总满意度高于抗酸染色法与培养法，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 荧光定量PCR、抗酸染色法及培养法用于诊断肺结核患者中均具有较高的临床价值，但荧光定量PCR法优势更大，具有操作简单、快捷等优势，能够为疾病早期诊断及预防提供有效参考依据，值得应用及推广。
　　[关键词]结核分枝杆菌；痰涂片；肺结核；诊断
　　[中图分类号] R521 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2019）4（c）-0150-04
　　Clinical value of real-time PCR in diagnosis of Mycobacterium tuberculosis DNA in sputum of patients with pulmonary tuberculosis
　　XIE Jing-qi ZHOU Jiao-hong
　　Department of Clinical Laboratory， Chen Xinghai Hospital of Zhongshan City in Guangdong Province， Zhongshan 528415， China
　　[Abstract] Objective To investigate the clinical value of real-time PCR in diagnosis of Mycobacterium tuberculosis （TB） DNA in sputum of patients with pulmonary tuberculosis. Methods Twenty-five patients with tuberculosis or old tuberculosis were enrolled from July to November 2017. Twenty-five healthy subjects were selected as subjects during the same period. Real-time PCR， the acid-fast staining method and the culture method were used to detect the TB of the examinee， and the positive rate of detection and patient satisfaction were observed and evaluated. Results The positive rate in detection of tuberculosis or obsolete tuberculosis of real-time PCR was higher than that of acid-fast staining and culture method， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The sensitivity of real-time PCR was higher than that of acid-fast staining and culture method， and the difference was statistically significant （P<0.05）. There was no significant difference among the quantitative PCR， acid-fast staining and culture method in the specificity （P>0.05）. The total satisfaction of the real-time PCR method was higher than that of the acid-fast staining method and the culture method， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion Real-time PCR， acid-fast staining and culture methods have high clinical value in the diagnosis of tuberculosis patients， but the quantitative PCR method has the advantages of greater operation， simple and fast operation， and can provide early diagnosis and prevention of diseases， which is worthy of application and promotion.
　　[Key words] Mycobacterium tuberculosis； Sputum smear； Tuberculosis； Diagnosis 　　肺结核是临床上较为常见的疾病之一，发病率呈日益上升趋势，若不早期进行有效诊断及治疗会给患者的身体健康造成严重影响，目前临床上诊断该病手段较多，其中最為常用方法之一在于抗酸染色法，具有操作简单、方便等优势，但是于实验过程中可受涂片、染色误差的影响进一步降低检测敏感性。临床上将痰培养方法作为诊断金标准，具有极高的确诊率，但是培养周期较长，可在一定程度上耽误患者的最佳治疗时机，且让病情进一步加重，与此同时存在假阳性率及假阴性率。而荧光定量PCR法具有确诊率高、操作简单、快捷等优势，广受医生及患者青睐[1]。本研究旨在探讨荧光定量PCR法用于诊断肺结核患者痰液中结核分枝杆菌（TB）DNA的临床价值，现报道如下。
　　1资料与方法
　　1.1一般资料
　　选取2017年7～11月我院收治的25例肺结核或陈旧性结核的患者，其中男12例，女13例；年龄25～70岁，平均（47.52±1.13）岁。纳入标准：①均符合肺结核的诊断标准，经相关检查确诊[2]；②存在盗汗、咳嗽、咯血、潮热等一系列临床表现；③存在消瘦、贫血、肺部湿罗音等体征；④经X线检查发现肺部组织存在空洞、钙化、浸润等。排除标准：①于入院治疗前存在严重肝肾疾病；②存在恶性肿瘤等疾病；③存在宫颈癌等疾病；④合并艾滋病及梅毒等传染性疾病；⑤存在严重心力衰竭等疾病；⑥存在严重过敏史及药物禁忌证等[3]。另选择同期的25例非结核病呼吸道感染患者。所有患者均认知功能正常，同意参加本研究并签署知情同意书。本研究经医院医学伦理委员会批准。
　　1.2方法
　　采用荧光定量PCR法、抗酸染色法及培养法检测受检人员的TB，并对检测阳性率进行观察及评估。嘱咐患者于次日早、中、晚漱口后深咳，以便于取出痰液，装入一次性痰液杯中，加盖送检，采集标本过程中需格外注意其他痰液混入其中，以免影响实验室结果。
　　抗酸染色法：取痰液标本涂抹于载玻片上，随后对标本进行萋-尼氏抗酸杆染色处理，待染色完毕后，采用显微镜对载玻片进行检查，且在显微镜下按照《中国结核病防治规划-痰涂片镜检质量保证手册》所规定标准报告结果计数。
　　荧光定量PCR法：采用PCR方法检测TB，于痰液样本中加入2～3倍样本体积的4%NaOH溶液振荡混匀，静置液化30 min，取500 μl液化后的样本置于离心管（1.5 ml），12000 r/min，离心3 min，吸除上清；随后加入1 ml无菌生理盐水重悬沉淀12000 r/min，离心3 min，吸除上清，再加入50 μl核酸释放剂盖上管盖，100℃处理10 min，12000 r/min离心3 min，上清作为待测样本，且加入处理后的待测样本（5 μl）和40 μl PCR-mix置入PCR反应管，上机检测。
　　痰培养法：采用酸性改良罗氏培养基对TB进行培养，按照说明书进行操作。
　　1.3观察指标及评价标准
　　①观察并评估受检人员的检测阳性率及患者满意度。满意度采用问卷调查表评估，分为3个等级，总分值0～100分，80～100分为一级满意，60～<80分为二级满意，<60分为三级满意，总满意度=（一级满意+二级满意）/总例数×100%。②比较三种检查方法的敏感性及特异性。敏感性=真阳性例数/（真阳性+假阴性）例数×100%；特异性=真阴性例数/（真阴性+假阳性）例数×100%。
　　1.4统计学方法
　　采用SPSS 20.0统计学软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，计数资料以率（%）表示，采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
　　2结果
　　2.1三种方法检测肺结核或陈旧性结核患者阳性率的比较
　　荧光定量PCR法检测肺结核或陈旧性结核患者的阳性率高于抗酸染色法与培养法，差异有统计学意义（P<0.05）；抗酸染色法与培养法检测肺结核或陈旧性结核患者的阳性率比较，差异无统计学意义（P>0.05）（表1）。
　　2.2三种检测方法敏感性、特异性的比较
　　荧光定量PCR法的敏感性高于抗酸染色法与培养法，差异有统计学意义（P<0.05）；抗酸染色法与培养法的敏感性比较，差异无统计学意义（P>0.05）；荧光定量PCR法、抗酸染色法及培养法三种方法的特异性比较，差异无统计学意义（P>0.05）（表2）。
　　2.3肺结核或陈旧性结核患者满意度的比较
　　荧光定量PCR法的总满意度高于抗酸染色法与培养法，差异有统计学意义（P<0.05）；抗酸染色法与培养法的总满意度比较，差异无统计学意义（P>0.05）（表3）。
　　3讨论
　　肺结核是临床上较为常见疾病之一，主要是由TB感染所引起，能够累及全身多系统、多器官，具有极高的发病率及死亡率，同时也是一种人畜共患传染病，若不及时进行早期诊断及治疗，任其发展，可对患者身体健康造成严重威胁；该病在临床上具有多样化特点，早期无明显临床症状，可起病初期发生食欲减退等症状，且持续数周的发热，与此同时患者可伴有精神不振、消瘦、乏力及手足心潮热等表现[4-6]。目前在临床上通过检测痰液中的TB判断患者是否存在肺结核疾病，检测方法包括三种，即PCR法、抗酸染色法及培养法；其中以培养法作为临床上金标准。同时也会选择采用胸部X线片检查，但是诊断效果令人不满意，即无法确诊肺结核，且容易发生误诊及漏诊事件，主要是因为肺炎、肺部肿瘤等疾病均存在肺结核相似的X线片影像，因此临床上通常选择以上三种方法检测痰液中细菌，同时也是诊断肺结核唯一指标[7-9]。抗酸染色法在临床上得到广泛应用及推广，具有操作简单、方便等优势，但是能够在一定程度上受操作者的主观性影响，继而降低检测的敏感性；而痰培养技术具有较高的诊断确诊率，主要是通过专门的培养皿，于合适的外界环境中培训菌群，即遵守致病菌高于污染菌原理，但其培养周期较长，同时存在一定假阳性率及假阴性率，且实验操作较为复杂[10]。也有学者建议选择PPD试验方法，主要是通过致病菌，让机体产生致敏淋巴细胞，继而与致病菌再次接触发生反应，可在皮肤表面直接表达，具有操作快捷等优势，但是经实践发现敏感性及特异性较低，仅能作为辅助临床诊断手段[11-12]。 　　荧光定量PCR法在临床上得到广泛应用及推广，主要是通过对PCB循环产物的检测，继而进行定量分析，具有操作简单、方便、敏感度高、特异性高等优势[13-15]。本研究结显示，荧光定量PCR法检测肺结核或陈旧性结核患者的阳性率高于抗酸染色法与培养法的阳性率，差异有统计学意义（P<0.05）。抗酸染色法阳性率较低的主要原因在于痰液中TB分布不均匀，导致观察数量受限，因此选择荧光定量PCR法测定TB的意义重大，可在早期疾病诊断及预防中提供可靠指导依据。
　　综上所述，荧光定量PCR法、抗酸染色法及培养法用于诊断肺结核患者中均具有较高的临床价值，但荧光定量PCR法优势更大，具有操作简单、快捷等优势，能够为疾病早期诊断及预防提供有效参考依据，值得应用及推广。
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　　（收稿日期：2018-12-27 本文编辑：闫 佩）
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